帕喬利的描述非常有意思，因為他那時與列奧納多交往甚密，因此這段評論可能也反映了列奧納多本人的觀點，即“專注”和“驚愕”的程度，眾人把焦點聚集在耶穌身上，以及門徒之間發生的聯繫。這幅畫就這樣形成了：人物並不處在一條直線上，而是交錯在一起，口中唸唸有詞：“不是我，是另一個人。”
還有就是猶大。他是這幅畫的反面人物，但在為準備《最後的晚餐》而作的側面像習作（溫莎皇家圖書館藏）中，猶大是一個比魔鬼還要醜陋的人，幾乎就是一個怪物，但他也表現出某種懊悔和自我憎惡的意味，這也使這幅側面像帶有某種悲劇色彩，或準確地説帶有基督教的仁愛之意。（最近對這幅畫進行的修補恢復了以往修補過程中失去的面部表情的細微之處。修補之後要比修補之前更接近作品初始的樣子，這幅猶大側面像就是個例子。）在聽到耶穌的話後，當他的手都已經接近碟子裏的麵包時，他向後退縮了。關於列奧納多畫的《最後的晚餐》中的猶大的臉，瓦薩裏曾講過一個趣聞：聖瑪利亞感恩教堂修道院院長總是催促列奧納多“儘快完成這項工作”，並向公爵抱怨這個藝術家如何拖延時間。得知此事後，列奧納多對盧###科説他還在尋找一個長著極為陰險毒辣的臉的人作猶大的原型，但如果實在找不到合適的臉，“他一定會用那個不夠善解人意、缺乏耐心的修道院院長的頭部”作為模型。聽到這番話之後，公爵頓時狂笑不止，而“那個不幸的修道院院長糊裏糊塗地回到家裏，還擔心在他的花園裏工作的工人”。這是瓦薩裏講的趣聞中有一定真實性的一個，至少當時還有人親眼看到這一幕。這個故事同樣也出現在1554年出版的賈姆巴蒂斯塔·吉拉爾迪·辛蒂歐寫的《羅馬史論》中，而辛蒂歐則是從他的父親克裏斯託福羅·吉拉爾迪那裏聽來的。克裏斯託福羅·吉拉爾迪是費拉拉的外交官，他在米蘭的時候跟列奧納多有私交。吉拉爾迪的這個版本近似于列奧納多本人的講話實錄：
最後只剩下猶大的頭部沒有畫。眾所週知，猶大是一個大叛徒，因此應該用一張能夠表現他的全部邪惡品質的臉來描畫他……有一年，或者更長的時間，我每天早晨和晚上都去波戈託大街，所有最卑鄙無恥的人都住在那裏，他們中大多數人道德敗壞。我去那裏是希望看到一張適合表現這個邪惡的人的臉。不過直到今天，我還沒有找到……如果最後發現我找不到，我將不得不借用這位神父，這位修道院院長的臉。
不管這個故事是否屬實，這段文字近似于列奧納多本人觀點的真實記錄。這是熟悉他的克裏斯託福羅·吉拉爾迪記憶中或者想像中的列奧納多講的話：“有一年，或者更長的時間，我每天早晨和晚上都去波戈託大街……”
繪製《最後的晚餐》首先要在修道院餐廳的墻上均勻地涂上一層灰泥，這層灰泥構成壁畫的基礎。墻壁中間是壁畫的主體部分，中間的灰泥要比旁邊的灰泥粗糙一些，因為這樣灰泥才能與覆于其上的漆層粘合得更加牢固。我們可以看到灰泥與漆層的交界處，那是一條模糊的水準線，靠近用透視法描繪的天花板的中間位置。最近一次修補工作中有一個發現——人們發現《最後的晚餐》草圖的痕跡，草圖是直接畫在灰泥之上的，“極為簡潔的紅線條，用流暢的畫筆描繪上去……按照他的佈局勾畫出眾人的輪廓或外形。”繪上草圖之後再打上熟石膏粉或底子。現代的高科技分析顯示當時用的石膏粉是“一種小顆粒狀的混合物，100－200微米厚，是用類蛋白質將鈣碳酸鹽和鎂粘合而成”，頂層再涂上一層薄薄的鉛白色的底漆。在這個階段，列奧納多故意在表面留下一些切口，主要是為了勾畫出建築背景的形狀和全景；為了追求作品的精確性，圖畫區域的中心還打上一個小孔，作為整幅壁畫的沒影點。在放大的照片中能看到這個點：這個點就在耶穌的右太陽穴上。
所有的這些準備工作告訴我們這是一項作坊成員的集體工作（班代洛的記述中遺漏了這一點，使人誤以為他在藝術創作時是孤獨一人）。米開朗基羅一人包攬了西斯廷教堂壁畫的所有工作，但《最後的晚餐》並不是列奧納多一個人的功勞，他手下還有一幫助手。其中很可能有馬可·德奧焦諾，他可能繪製過《最後的晚餐》的最早的臨摹畫；薩萊當時大約16歲，是列奧納多的夥計；可能還有托馬索·馬西尼，有資料證明他後來參與製作一幅大型的壁畫（佛羅倫薩的《安加利之戰》壁畫）。他們是列奧納多信任的助手，此外他或許收了一些新的學徒和助手，我們可以在《大西洋抄本》的兩頁紙上看到這些人的名字：
9月8日，約蒂提來了，一個月4達克特。
10月17日，貝內代托到來，一個月4達克特。
這個筆記應該寫于1496年或1497年。4達克特是列奧納多向他們索要的膳食費和住宿費；除了這些費用，作為助手，他們還可以賺一些收入。就這樣，到當年年底，貝內代托差不多賺了39里拉——只少於10達克特——差不多正好夠支付他的膳食費，為掙這筆錢他花了10個星期的時間。貝內代托的名字也出現在一張未標明日期的筆記上，頁邊的空白已有部分被剪掉，上面記錄了大約同一時期列奧納多工作室裏的人手：
