列奧納多在1508年頭幾個月的生活(正如結果顯示的那樣，最後一個月他是在佛羅倫薩度過的)似乎奇怪地與抄寫有了瓜葛，人們甚至會説這如同公證人的日子一般。列奧納多坐下來寫作時，他那位於拉加大街的小書齋裏成堆的文件好像要把他變成矮子一樣。他的肩膀彎成了弧形，鬍子變得有點灰白，視力給他造成了極大麻煩。這一時期列奧納多從事過一些我們近乎一無所知的藝術活動——為路易國王繪製“尺寸不一的兩幅聖母畫像”；一直創作並修改《蒙娜麗莎》；對魯斯蒂奇西禮堂群雕提出建議；或許還有最後潤飾《安加利之戰》的巨幅片斷——不過這卻沒有相關記載，也沒有他與行政長官的來往（要是有的話）的記錄。列奧納多丟棄了這些關係，就像他放棄那些繪畫那樣容易。精神病學家可能會説，這是列奧納多從其父那裏學來的一門技藝。
或許，列奧納多在佛羅倫薩最後幾個月進行最為重要的一項活動時，手中拿的不是鋼筆或畫刷，而是一把解剖刀，這活動為廣受重視的調查研究揭開了嶄新的一章。在1507年晚期或1508年早期一份著名的備忘錄中，列奧納多記下了他對一位老人屍體的解剖過程：
這位老人在去世之前幾個小時告訴我，他活了一百多歲，除了身體虛弱之外沒有感到其他毛病。坐在佛羅倫薩新聖母瑪利亞醫院的病床上，他沒有任何痛苦的動作或跡象就離開了人世。我對屍體進行了解剖，以查明是什麼造成了這種甜蜜的死亡。
也正是在這時，列奧納多解剖了一個兩歲兒童的屍體，“我在其中發現了與那位老人屍體恰好相反的一切”。
列奧納多現在主要對血管系統産生了興趣。在一張繪有胳膊表層血管的草圖中，他註明了那位“老人”與“孩子”之間靜脈和動脈的差異。列奧納多懷疑老人停止呼吸是因為“動脈缺乏滋養心臟及其下層組織的血液，從而引起身體虛弱所致”。他發現動脈“又幹又窄，有些乾癟”，“除了血管壁變厚之外，脈管變長了，像蛇一樣扭曲著”。列奧納多還注意到肝臟因為失去了充分的血液供應，“顏色和成分都如同凝固的麩皮一樣乾枯了”；那位老人的皮膚“顏色像木頭或幹栗子一樣，因為皮膚幾乎完全失去了滋養”。在相關的一頁上，列奧納多還討論了心臟和肝臟究竟哪個是血管系統的主要器官，並最終斷定心臟是主要器官（認同亞裏士多德的觀點，反對伽林的看法），他把心臟比作了“血管圖”從中孕育成長的桃子硬核。
這些語言（蛇，麩皮，木頭，栗子還有桃核）非常符合實際生活，如同教材一般，這與列奧納多在15世紀80年代後期較早的解剖學著作中採用的更加抽象的語言形成了鮮明對比。當時列奧納多在解剖上主要關注官能、“主要活力”的輸送以及其他中世紀的假設。列奧納多在1508年晚些時候寫成了一本論述光學的小冊子（現在的巴黎手稿D），我們從中可以發現偏離形而上的類似跡象。這本小冊子強調了眼睛在本質上易於接收外界事物，還有不存在從眼睛發射出來任何無形或“心靈”的光線（傳統模式認為感覺就是以這種方式具有前攝性的）。正如列奧納多喜歡訴説的那樣，眼睛可能是“心靈的窗戶”，但它同時也是一台微型機器，其運轉部分必定要被分解或被人了解。
在1508－1509年這同一時期，列奧納多還繪製了一些與肺臟及腹部器官有關的漂亮圖表。畫的或許是豬的器官，圖表再度伴有和植物進行的類比。這些圖表説明，列奧納多當時是如何同顯示解剖的問題苦苦進行著抗爭，他在積極尋求一種能把表面細節和透明性結合起來的繪圖技巧。瓦薩裏記載了與列奧納多有關的一段軼事，説他把豬內臟充滿了氣，直到內臟擠滿了房間。這個插曲就是列奧納多解剖豬的一個恐怖注解。列奧納多喜歡讓人感到驚慌不安，這是他性格中戲劇性的一面。
此時還出現了一幅畫有女人擴大的陰戶的素描。即使這幅素描表現的是一胎多子或産後的婦女，那生殖器還是不切實際得如同洞穴一般。 我很想把這奇怪的誇大和列奧納多關於“洞穴”的早期文本聯繫起來，並借此説明，列奧納多對探究“危險黑洞” 表現出了恐懼，這恐懼的一部分是和女性性徵那令人煩擾的秘密相衝突的。根據弗洛伊德的解釋，在洞穴之內可以瞥見的“奇物”是關於生殖和出生的秘密。然而，在這素描下面的注解中，列奧納多卻滿足於一個更加簡潔的象徵：“陰戶邊上的褶皺告訴了我們城堡守門人的位置。”把女性生殖器設想為一個“城堡”或“要塞”，要遭到堅持不懈的男性包圍和攻破，這在愛情詩中司空見慣。
在相關的紙上還有一幅草圖，畫的是一位站立的女性顯示自己懷孕早期時候的子宮，還有幾幅男性和女性生殖器的素描，一幅奶牛內懷胎兒的子宮習作，還有一份奶牛胎盤的局部圖，列奧納多將胎盤組織描述成了“如同粘附物一樣交織在一起”。這些關於繁殖的習作似乎與列奧納多在1508－1509年間創作的《麗達》的生殖主題有著某種聯繫，因為這位孕婦的輪廓在視覺上重復了麗達的形象。紙張精美的反面是嘴巴及其肌肉的習作，其中那些幽靈般的嘴唇似乎以柴郡貓般的風格從蒙娜麗莎的臉龐漂流而來。
關於“那位老人”的這些注解寫于1507年晚期或1508年早期，它們最早明確指出了列奧納多曾親自進行過一次人體解剖。但或許以前他就解剖過其他屍體了，因為在另一張談論解剖的紙張（1508年）上，列奧納多聲稱他曾親自解剖過——肢解成碎塊——“十多具人屍”。為了“正確完美地了解”人體血管，列奧納多已經“把這些血管周圍的人肉去除得絲毫不剩，除了毛細血管一滴幾乎看不見的流血之外。這幾乎沒有引起任何流血”。列奧納多還記錄了在冷凍出現之前解剖屍體時的程式問題：“由於一具屍體持續的時間不長，因此很有必要接連使用幾具屍體，以便可以得出關於血管的完整結論。為了發現其中的差異，這個過程我重復了兩次。”列奧納多描述了這項任務的挑戰性和由此帶來的真正恐懼。“你們”——即將成為解剖學家的讀者們——“可能會因為肚子的隆起而打退堂鼓”。
正如解剖“那位老人”和“孩子”的屍體一樣，有些解剖顯然是在新聖母瑪利亞醫院進行的。列奧納多很熟悉這個地方，那是他的儲藏室，偶爾也用作倉庫。列奧納多這麼做肯定得到了某種官方的許可——1506年，即使佛羅倫薩畫室中的“醫生和學者”在聖克羅切進行公共解剖之前，也必須得到官員允許——但看來好像列奧納多完成的這些解剖並非都是在那裏進行的。列奧納多充滿感情地談到了“午夜時候的恐懼，因為身邊都是一些經過肢解和剝皮的死人，看了不禁令人毛骨悚然”。列奧納多或許對屍體解剖進行了誇大，但其中的弦外之音在於他是在自己的寓所或畫室內進行解剖的，因此才産生了他在屍體陪伴于身邊時度過黑夜的那種恐懼。要是他在新聖母瑪利亞醫院解剖屍體，就不會感到恐懼了。
屍體解剖當時仍然存在爭議。得到特許去進行解剖是可以的，但解剖仍然是項可疑的活動，其周圍聚集著大量的謠言和迷信——這就暗示了它是一種“妖術”，迷信以及中世紀魔法的混合物。經常使用絞刑架下的屍體更加讓人不寒而慄。列奧納多急於使自己擺脫這些東西，這就是為什麼他在描述屍體解剖的文章中也英勇地攻擊了那些招搖撞騙的術士：
自然會替自身向那些希望實現奇跡的人們報仇……因為他們總是生活在最可怕的貧窮之中。對於那些力圖製造金子和銀子的煉金術士，那些希望從死水中創造出永不停歇的能量的工程師們，那些在所有人中最為愚蠢的巫師和魔術師來説，情況現在如此，將來也永遠都是如此。
列奧納多後來在羅馬時，從事的研究使他與教會産生了衝突。一個幸災樂禍的人把列奧納多的活動向教皇作了彙報，結果列奧納多被“禁止進行屍體解剖”。隨著反宗教改革的進行，這樣的態度強硬起來。半個世紀之後，比利時偉大的解剖學家，也就是《解剖學》的作者安德烈亞斯·維薩裏因為“掘墓盜屍”和進行解剖被宗教裁判所判為死刑。判決後來改為讓維薩裏到耶路撒冷朝聖，但他在回來的途中就過世了，享年五十歲。
當列奧納多談到他在幾具屍體的包圍下度過夜晚時，我們得到一點暗示，他在緊閉的門後偷偷進行屍體解剖，這帶有一點離經叛道的色彩。對列奧納多來説，調查的需要總比個人舒適和教義安全的需要來得強烈。
