不久之後，列奧納多又用紅粉筆畫了一幅草圖，後來這幅紅粉筆畫又被其他人用墨水描了一遍，該圖現存放在威尼斯學院美術館。該草圖顯得比較粗糙，很大程度上應歸咎於墨汁的影響，不過《最後的晚餐》的均勻的佈局在這幅草圖上已初顯端倪。眾門徒被分成了幾組，畫面更注重人物的個性特徵。為了明確人物身份，人物形象下面出現了匆忙寫就的説明文字（其中菲利普被提到了兩次）。但猶大仍然在桌子的靠近觀者的一側，約翰依然睡得很沉。
這些素描讓我們看到了列奧納多關於此畫的早期想法。他迅速而聚精會神地做好微型藍圖，心中不停問自己——是這樣畫還是那樣畫？但正如列奧納多常會表現的那樣，他的繪畫基礎非常紮實，儘管這些素描是第一批真正為聖瑪利亞感恩教堂的《最後的晚餐》所作的習作，但我們在他的素描簿中找到了另一張年代更早的紙張，可以追溯到15世紀80年代，上面畫著三幅互有關聯的素描：一群人坐在桌子旁邊，有一人單獨坐在桌前，雙手托著腦袋，還有一個人毫無疑問就是耶穌，他的手指指向那個命中註定的碟子。這三幅素描並不是為《最後的晚餐》所作的習作，因為畫中只有五個人坐在桌旁愉快地聊天以打發時間，他們並不是耶穌的門徒。畫中場景可能是發生在某次鄉村的歡宴中，人們圍坐在桌前。但不知是什麼激發了列奧納多的靈感，使他在同一頁紙上迅速畫下吃聖餐的基督這一令人心酸的場景，十五年之後這個想法終於在那幅偉大的米蘭壁畫中開花結果。
溫莎皇家圖書館和威尼斯藏有的素描的重心逐漸從整體佈局轉移到單獨人物形象特徵上面。溫莎皇家圖書館藏有著名的系列頭像，大多數用紅粉筆畫成，有一些已經畫得比較完整。那些人物形象終於變得清晰起來：猶大、彼得、大雅各、聖菲利普（幾乎可以肯定，最後兩個形象用的是同一個模特，只不過在圖畫中被賦予了鮮明的個性特徵）。其中有一幅聖約翰雙手的習作，畫面非常精美；還有一幅習作上畫著聖彼得的衣袖。“福斯特筆電”中還有一些簡短的評論，對這些習作進行了補充——某位來自帕爾馬的亞歷山大為耶穌的手提供原型；“住在比塔的克裏斯托法諾·達·卡斯蒂廖內的頭部的形狀很美”。其中有一處筆記，標題非常簡單，就寫著“耶穌”兩字，列奧納多在下面寫著“摩塔洛紅衣主教手下的喬瓦尼·孔蒂”，這個人可能就是耶穌的模特。阿拉貢有位消息靈通人士名叫路易吉，他在1517年親眼見過《最後的晚餐》，據他記載，畫中的一些門徒是“米蘭朝臣和知名市民的真實肖像”。
在一個著名的片斷中，列奧納多列出了一些門徒聽到基督宣言後的各種反應：
一個正在喝酒的門徒把酒杯放回原位，把頭扭向説話人。
一個扭動手指的人，轉向他的同伴，表情十分嚴肅，展開雙臂，露出掌心，肩膀上聳，碰到了他的耳朵，驚訝地張大嘴巴……
一人轉過身，手裏拿了一把刀子，碰倒了桌上的玻璃杯……
一個人身體前傾望著説話者，雙手遮住了自己的眼睛。
其中一些人物描寫在最後完成的壁畫中得到了體現，比如白鬍子的聖安德魯（從左邊數第三個人）攤開他的掌心，聳起他的肩膀。而其他人的動作都發生了改變，轉過身、手中拿把刀子的那個人變成了聖彼得，而碰倒玻璃杯的則變成了另一個人，他就是打翻鹽瓶的猶大。這些姿勢中至少有一個早已出現在溫莎皇家圖書館收藏的第一幅構圖素描中，即人數較少的那組人像中，耶穌和猶大之間的那個人“用手遮住了眼睛”。
與整體構圖一樣，這些帶有感情色彩的動作體現了列奧納多《最後的晚餐》中嶄新的理念：他摒棄了從中世紀流傳下來的構圖傳統，即信徒們沿著桌子呆板地坐成一條直線。在佛羅倫薩，列奧納多應該看到過塔代奧·加迪、安德烈亞·德爾·卡斯塔尼奧、安吉利科修士和多梅尼科·吉蘭達約各自繪製的《最後的晚餐》。吉蘭達約是在萬聖修道院餐廳繪製的《最後的晚餐》，壁畫優雅精緻，但缺乏活力，該壁畫完成不久列奧納多才前往米蘭。在列奧納多《最後的晚餐》中，用餐者的線條被打斷了，取得了神奇的效果。呈現在我們眼前的是波浪狀的一群人，彼得羅·馬拉尼把這種波浪形看做是“巴黎手稿C”中的光學圖示。門徒們被分成四個組，每組三個信徒：聚整合群的這些信徒突然處在了一個緊要關頭。列奧納多也找到了他戲劇性的一刻：不是聖餐儀式，也不是確認猶大的身份，而是眾人在聽到耶穌宣佈消息時極度震驚的反應——“只有在你們面前我才能肯定地説，你們中間有人將要背叛我。”眾信徒悲痛萬分。（《馬太福音》26:21－2）因而，畫面佈局的流暢部分是由基督的這個決定造成的，即講故事的那一刻出現的，幾乎就是電影中的一幕。盧卡·帕喬利是最早對這幅壁畫作出評論的人之一，他對這一點有過絕佳的詮釋。1498年12月14日，他在為自己著的《神聖的比例》一書寫的獻辭中説道：
在眾門徒聽到那個聲音説出“有人背叛了我”的時候，我們很難想像他們當時的表情專注到什麼程度。通過行為和手勢，門徒們似乎在互相對話，一個人跟另一個人説，而那個人又跟旁邊另一個人講，都顯得驚訝不已。就這樣，我們的列奧納多用他那巧奪天工之手創造了這戲劇性的一刻。
