MRD定制化panel用於臨床研究的策略

隨著迴圈腫瘤DNA(ctDNA)技術的飛速發展,應用ctDNA檢測實體瘤MRD已經成為當前的熱點。

MRD指腫瘤患者接受根治性治療後即便達到完全緩解(CR),體內仍然殘存有腫瘤細胞的狀態。這個概念首先是出自血液病,在血液病的治療過程中我們發現,在大量的化療治療後,在血液裏面還能檢測到癌細胞,由於殘留的細胞數量較少無法在影像學中檢測到,所以稱之為微小殘留病灶。 在2021年6月發佈的《非小細胞肺癌分子殘留病灶專家共識》中,定義肺癌分子殘留病變為經過治療後,傳統影像學(包括PET/CT)或實驗室方法不能發現,但通過液體活檢發現的癌來源分子異常。這些分子殘留病變代表著肺癌的持續存在和臨床進展可能。肺癌MRD的檢測具有多項功能,可用於患者的預後預測、風險分層、復發監測、療效評估等,從而實現非小細胞肺癌患者圍術期的全程動態監測管理。但因為微小殘留病灶極小或殘留腫瘤細胞量極少,通過傳統影像學或其他實驗方法已經很難檢測到,因而需要更加靈敏的檢測技術。

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圖1 MRD檢測發展歷程

隨著迴圈腫瘤DNA(ctDNA)技術的飛速發展,應用ctDNA檢測實體瘤MRD已經成為當前的熱點。   

一、微小病灶殘留臨床檢測策略

目前,對於微小病灶殘留的檢測,主要包括三大類: (1)基於固定組成的大panel:使用類似TMB的大panel進行大範圍的ctDNA檢測,如吉因加、世和、和瑞的固定化panel;優勢在於開發成本低,可實現高通量生産,但能保證的單點測序深度較低。 (2)基於定制化的小panel:使用個性化定制的panel(多為多重PCR)對某幾個位點進行檢測(一般8或16個),可實現>10000×的測序深度,如華大,Guardant,GRAIL等;優勢在於測序成本低,單點深度高,但需要針對患者進行個性化定制,開發成本較高。 (3)聯合SNP和甲基化檢測的panel:在前兩者基礎上,聯合甲基化檢測對tumor來源的ctDNA進行組織定位,從而提高準確性。目前國內主要以燃石為代表。

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圖2 MRD檢測主要技術路線

從微小殘留病灶的臨床性質可知,釋放入血的ctDNA含量極其微量,無論是哪種方法,都需要對超低豐度的ctDNA有著較好的敏感性。Asaf Zviran等人建立了輸入的血漿量與檢測到的tumor腫瘤數量的雙端皮爾遜檢驗模型,發現二者具有相關性,從而證明了input核酸量時限制靶向測序突變檢測的潛在限制因素。同時,他們證明了WGS可以獲得比靶向捕獲測序更高的突變檢出率。基於這一研究結果,用測序廣度替代測序深度來克服cfDNA低起始量是可靠的,MRDetect即基於該原理進行開發,靈敏度可達10^-5。 然而,MRDetect採用WGS的方法進行檢測,意味著將導致巨大的檢測成本,不利於MRD需要長期隨訪動態檢測的特性。因而,目前的定制化方法大多采用廣度和深度結合的策略。一般,對腫瘤組織進行WES或較大panel的廣度篩選,從中挑選若干有意義的體細胞突變,設計定制化的小panel,使用這些小panel對血液中cfDNA進行檢測。這種方案兼顧了不同患者之間的差異性與檢測本身的精確性,已經逐漸成為國外各個基因檢測公司的首選,目前Natera的IVD産品即基於該方法。

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基於LC目前技術平臺的實際情況,Natera的方法具有較高的可信性:即先基於Agilent or IDT的全外顯子探針對患者的腫瘤組織(FFPE)進行檢測,從中挑選出有意義的體細胞突變,基於Variant Pro系統進行定制化panel設計(需帶有UMI),預期檢測0.02%級別以上的ctDNA突變。   

二、微小病灶殘留檢測的臨床意義

目前,臨床上對MRD檢測的意義包括以下三類:

(1)根據MRD檢測結果預測用藥療效 傳統的ctDNA檢測已經被廣泛地應用在用藥療效檢測上,典型的如血液EGFR T790M突變被用於指示EGFR 一代TKI的耐藥。在此基礎上,有更多的證據證明,ctDNA殘留水準可以指示更多的藥物療效。Powles T等人發現,ctDNA陽性患者接受atezolizumab得到了改善,而ctDNA陰性組沒有顯著差異;6周後,atezolizumab組的ctDNA清除率高於對照組(18% vs 4%);同時,復發相關的基因在兩組之間也發生了差異表達。Bratman S V等人發現,ctDNA在免疫檢查點抑製劑(ICB)治療前後發生的變化,可以指示ICB的療效:ctDNA清除率高的患者意味著較好的ICB應答。

(2)根據MRD檢測結果監控腫瘤復發 腫瘤復發來源於體內未被清楚的癌細胞,因而,檢測癌細胞釋放的ctDNA通常比傳統的放射檢查(如CT)更早地發現復發的腫瘤。Charles Coombes等人在49位乳腺癌患者中持續檢測血液ctDNA突變情況,顯示ctDNA陽性的患者,預後顯著差于陰性患者,且隨著時間進展,ctDNA陽性患者的突變VAF會逐漸升高,證明了cfDNA圖譜可以用於檢測乳腺癌復發。Tarazona N等人檢測了150位局限性結直腸癌患者的血液ctDNA變化,並進行ddPCR驗證,證明了ctDNA的存在與早期復發相關,比放射性檢查要早;且追蹤至少2種突變可以提高MRD的識別能力到87.5%;同時證明了在連續的血漿樣本中使用多個突變跟蹤可以提高MRD的準確性[5]。這一結論也支援了需要採用多個突變位點進行高深度測序來監控MRD。Chaudhuri A A等人利用CAPP-Seq進行超深度測序,證明MRD可以可靠鑒別腫瘤復發,且72%的患者ctDNA進展比放射學進展快5.2個月。 對於一些沒有熱點突變的癌種,MRD檢測同樣具有指導預後的能力。Lee B等人首次提出對於沒有生物標誌物來指導治療方案選擇時,可以評估cfDNA的變化來指導預後:在胰腺癌患者中,他們發現檢測到ctDNA的患者(13/13)均發生了復發,表明cfDNA在術前術後的變化可以作為一個預後治療,可以對術後檢測ctDNA陽性的患者進行強化治療策略。

(3)根據MRD檢測結果聯合分析無復發生存期(RFS)和總生存期(OS) MRD不僅可以作為一種生物標誌物指導復發的可能性,也可以作為預後指標用於預測患者的無進展生存期和總生存期。Bratman S V等人採用△ctDNA聯合傳統的RECIST模型可以提高Cox模型預測OS的準確性,ctDNA陰性代表著更好的預後。Peng M等人採用cSMART技術檢測非小細胞肺癌腫瘤組織中的體細胞突變和血漿中的MRD,並採用kaplan-meier和Cox回歸分析評估RFS和OS,證明ctDNA的檢出與RFS和OS負相關。   

三、微小病灶殘留檢測相關臨床試驗設計

Maria Coakley等人在Clinical Cancer Research上發表了關於MRD臨床試驗設計的具體策略,具體如下: (1)實體瘤切除後輔助治療療效尚不確定的癌種(如II期結直腸癌) ① 隨機型:將入組病例隨機分為兩組,一組進行常規的輔助化療;另一組基於MRD檢測結果,ctDNA陽性患者進行輔助化療,ctDNA陰性患者不進行干預,並持續檢測MRD水準。保持隨訪,評價無病生存期(DFS) ② 非隨機型:對入組病例進行MRD檢測,對ctDNA陽性患者進行化療,ctDNA陰性患者不進行干預並持續檢測MRD水準。保持隨訪,評估無病生存期。 該類研究主要證明ctDNA陰性具有較好的預後,且化療並不能使他們獲得DFS益處。通常採用隨機型試驗,非隨機型試驗需要的入組病例更低,但必須要求腫瘤具有較低的復發風險基線。

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圖3 輔助治療尚不確定的癌種臨床試驗設計

(2)實體瘤切除後具有標準輔助治療策略的癌種 ① 隨機型:對入組病例進行MRD檢測,ctDNA陰性患者繼續進行標準治療;ctDNA陽性患者隨機分成2組,一組在標準治療基礎上增加額外治療,而另一組在標準治療基礎上增加安慰劑處理。持續隨訪驗證ctDNA清除是否可以替代DFS作為研究終點 ②非隨機型:對入組病例進行MRD檢測,ctDNA陰性患者繼續進行標準治療,ctDNA陽性患者在標準治療基礎上增加額外治療。持續隨訪,驗證ctDNA的清除情況。 該類研究主要用於指導額外的治療手段是否需要進行。通常採用隨機型的方法,只有當ctDNA已經被證明可以替代DFS作為研究終點時,可以採用非隨機型的方法。同時,ctDNA的檢測結果也可以作為疾病的分型參考指標。

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圖4 具有標準輔助治療策略的癌種臨床試驗設計

(3)高風險惡性實體瘤

一般採用隨機型試驗,將入組病例隨機分為兩組,一組採用傳統的輔助治療,另一組採用傳統輔助治療和新的治療手段,對兩組均進行持續的MRD檢測,評價MRD檢出情況和DFS。 該類研究主要用於證明MRD檢出情況可以替代DFS作為藥物開發臨床試驗的替代終點,從而縮短臨床藥物的審批時間,加速藥物開發流程,因而一般需要和藥廠聯合開展臨床試驗。

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圖5 高風險惡性實體瘤臨床試驗設計

Reference

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