快報 | 貝達喹啉對巨噬細胞耐多藥結核分枝桿菌感染模型作用的觀察

本研究觀察Bdq對巨噬細胞MDR-MTB感染模型的殺菌作用。

作者:呂霞麗,林婷婷,高靜韜,賈紅彥,朱傳智,李自慧,董靜,孫琦,舒薇,王賽賽,潘麗萍,黃海榮,張宗德,李琦

第一作者:呂霞麗 ,單位:北京市結核病胸部腫瘤研究所 首都醫科大學附屬北京胸科醫院 耐藥結核病研究北京市重點實驗室

通信作者:李琦,單位:北京市結核病胸部腫瘤研究所 首都醫科大學附屬北京胸科醫院 耐藥結核病研究北京市重點實驗室

Effects of Bedaquiline on Antimicrobial Activity and Cytokine Secretion of Macrophages Infected with Multidrug-Resistant Mycobacterium tuberculosis Strains

Lyu XL,Lin TT,Gao JT,Jia HY,Zhu CZ,Li ZH,Dong J,Sun Q,Shu W,Wang SS,Pan LP,Huang HR,Zhang ZD,Li Q.

Can J Infect Dis Med Microbiol,2022 ,2022: 2703635. 

doi: 10.1155/2022/2703635. 

PMID: 35449601 

背景

肺結核是一種慢性傳染性疾病。其中,耐多藥結核病(multidrug-resistant tuberculosis,MDR-TB)和利福平耐藥結核病(rifampicin-resistant tuberculosis,RR-TB)的治療則較為困難,其治療成功率較低。據2020年世界衛生組織(World Health Organization,WHO)報道:全球MDR/RR-TB患者的治療成功率約為57%,我國MDR/RR-TB患者的治療成功率僅為52%。因此,抗結核新藥的研發是結核病控制、特別是耐藥結核病控制的重要策略。在藥物研發中,利用生物學方法模擬宿主與病原菌間的相互作用將有助於了解耐多藥結核分枝桿菌的耐藥機制、抗結核新藥的療效及其機制,以便為MDR-TB的控制提供更好的治療方案。 貝達喹啉(Bdq)是一種二芳基喹啉類化合物,通過特異性抑制結核分枝桿菌的ATP合成酶而發揮殺菌作用,對結核分枝桿菌敏感株和耐藥株均有較強的殺菌活性。據2020年WHO結核病報告,含Bdq的化療方案已進入III期臨床試驗,有關Bdq的臨床療效已有報道,含Bdq的化療方案治療MDR-TB也具有較高的療效,但有關Bdq對巨噬細胞耐多藥結核分枝桿菌感染模型(簡稱MDR-MTB感染模型)的作用及其機制等少有報道。因此,本研究觀察Bdq對巨噬細胞MDR-MTB感染模型的殺菌作用;基於細胞因子參與巨噬細胞活化、吞噬、殺菌等功能,我們選擇既往報道較少的4個Th1/Th2(輔助性T細胞1/輔助性T細胞2)相關細胞因子,觀察其在Bdq作用於巨噬細胞MDR-MTB感染模型後的變化,探討可能的細胞免疫機制,為進一步完善Bdq的作用機制提供依據。

研究方法

1. 感染細胞實驗:將結核分枝桿菌接種到7H9培養基(含10% OADC和0.05%吐溫-80)中,37℃培養至對數生長期(吸光度值600 ≈ 0.6~1.0)。THP-1細胞在RPMI-1640培養基(含10%胎牛血清)中培養至合適密度,加入100ng/ml佛波酯36~48 h使其誘導分化為巨噬細胞,採用超聲分散儀將結核分枝桿菌進行分散和計數,按照感染複數(MOI)=10:1對細胞進行感染。37℃,5% CO2培養箱中孵育,計算感染時間。

2. 最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)測定:採用微孔培養顯色法(MABA)測定MIC,即7H9培養基重懸結核分枝桿菌(菌懸液濃度約為1×106 CFU/ml)。96孔板兩側加入200 μl生理鹽水。第2孔加入200 μl含10%OADC(oleic acid-albumin-dextrose-catalase,油酸-白蛋白-右旋葡萄糖-過氧化氫酶)的7H9培養基稀釋後的Bdq(2 μg/ml),3~11孔加入100 μl含10%OADC的7H9培養基,按照倍比稀釋加入Bdq。實驗重復3次。37℃培養箱內孵育7 d,每孔加入32.5 μl染色劑(20 μl Alamar-Blue和12.5μl的20% Tween-80),37℃培養箱孵育24 h。以藍色孔為無菌生長,粉色孔為有菌生長,液體由藍色變為粉色表明有細菌生長。MIC被定義為防止顏色從藍色變為粉色的最低藥物濃度。

3. 巨噬細胞胞內結核分枝桿菌的CFU計數(colony-forming unit Assay):向誘導分化的巨噬細胞中加入結核分枝桿菌感染4h,棄上清後PBS(phosphate buffered saline,磷酸鹽緩衝液)洗滌3~4次,之後分別加入藥物濃度為MIC、10MIC和20MIC的Bdq作用4h、8h、24h和48h。吸棄上清後每孔加入1ml含0.5%Triton X -100的PBS裂解液,吹打20~30次混勻。吸取100μl至含900μl PBS的1.5ml離心管中,依次做4個濃度梯度,即得細胞裂解液的10-1、10-2、10-3、10-1稀釋。取50μl細胞裂解稀釋液接種于7H10培養基上,涂勻倒扣于37℃培養箱孵育3-4周,計數菌落。實驗各重復3次。

4. 液相晶片多因子檢測Magnetic Luminex® Assay:向誘導分化的巨噬細胞中加入結核分枝桿菌感染4h,棄上清後PBS洗滌3~4次,之後分別加入藥物濃度為MIC的Bdq作用4h、24h和48h。無菌注射器吸去細胞上清,經0.22μm針頭過濾器除菌,分裝到無菌EP管中凍存備用。按照試劑盒説明書配製稀釋標準品、磁珠、生物素標記的抗體和Streptavidin-PE Concentrate等,將稀釋好的標準品和待測樣品加入到96孔板中,進行孵育、洗板等。Luminex® 200TM上機檢測細胞因子白介素-12/23 p40(interleukin-12/23 p40,IL-12/23 p40)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)和白介素-10(interleukin-10,IL-10)的變化。實驗各重復3次。

研究結果

一、Bdq細胞毒性實驗

Bdq對巨噬細胞增殖-毒性試驗見表1,從表中可見隨著作用時間的延長,空白孔、對照孔和實驗孔的OD450值呈現增高的趨勢。在同一時間點,隨著作用濃度的增加,實驗孔的OD450值呈現降低的趨勢。在不同的濃度和時間下,Bdq對巨噬細胞的存活率為100%,抑制率為0%。

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二、Bdq作用於MDR-MTB感染模型後的胞內CFU計數結果

Bdq作用於H37Rv和MDR-MTB感染模型後胞內CFU計數結果見表2。從表中可見:①Bdq以MIC劑量給藥後4~48h,H37Rv和MDR-MTB組胞內CFU計數分別較給藥前、較感染組(未給藥組)逐漸下降,給藥後48h達最低值(P<0.05)。②增加給藥劑量至10MIC和20MIC後8~48h,H37Rv和MDR-MTB組胞內CFU計數較MIC劑量給藥時進一步降低(P<0.05)。此外,H37Rv組10MIC和20MIC給藥後各時間點的胞內CFU計數相接近(P>0.05)。而MDR-MTB組以20MIC給藥後各時間點胞內CFU計數均低於10MIC給藥(P<0.05)。

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Bdq以MIC劑量給藥後對H37Rv和MDR-MTB感染模型胞內CFU計數比較結果見圖1。從圖中可見:給藥後4~24h,MDR-MTB組胞內CFU計數高於H37Rv組(P<0.05);而給藥後48h,兩組胞內CFU計數則相接近(P>0.05)。

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圖1 Bdq以MIC劑量給藥後對H37Rv和MDR-MTB感染模型胞內CFU計數比較結果

三、Bdq作用於MDR-MTB感染模型後4個Th1/Th2因子測定結果

1. Th1因子(IL-12/23 p40和TNF-α)表達量測定結果

(1)IL-12/23 p40表達量測定結果:Bdq以MIC劑量給藥後,H37Rv和MDR-MTB感染模型培養上清IL-12/23 p40表達量測定結果見表3。從表中可見:兩組給藥後各時間點IL-12/23 p40表達量較給藥前均無明顯變化,且兩組IL-12/23 p40表達量相接近(P>0.05)。此外,H37Rv組給藥後48h的IL-12/23 p40表達量低於感染組(P<0.05);MDR-MTB組給藥後4h的IL-12/23 p40表達量高於感染組(P<0.05)。

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(2)TNF-α表達量測定結果:Bdq以MIC劑量給藥後,H37Rv和MDR-MTB感染模型培養上清TNF-α表達量測定結果見表4。從表中可見:兩組給藥後24h、48h的TNF-α表達量均較給藥前增高(P<0.05),且兩組TNF-α表達量相接近(P>0.05)。此外,僅MDR-MTB組給藥後24h的TNF-α表達量高於感染組(P<0.05)。

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2. Th2因子(IL-6和IL-10)表達量測定結果

(1)IL-6表達量測定結果:Bdq以MIC劑量給藥後,H37Rv和MDR-MTB感染模型培養上清IL-6表達量測定結果見表5。從表中可見:兩組給藥後24h、48h的IL-6表達量較給藥前增高,且MDR-MTB組給藥後24h、48h的IL-6表達量高於H37Rv組(P<0.05)。此外,H37Rv組給藥後24h、48h的IL-6表達量均低於感染組(P<0.05)。MDR-MTB組IL-6表達量在給藥後24h高於感染組(P<0.05)。

6721653301231387  (2)IL-10表達量測定結果:Bdq以MIC劑量給藥後,H37Rv和MDR-MTB感染模型培養上清IL-10表達量測定結果見表6。從表中可見:兩組給藥後各時間點IL-10表達量均無明顯變化,且兩組IL-10表達量相接近(P>0.05)。此外,H37Rv組給藥後48h的IL-10表達量低於感染組(P<0.05);而MDR-MTB組給藥後24h、48h的IL-10表達量均低於感染組(P<0.05)。

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3. Bdq介導Th1/Th2因子變化與MDR-MTB感染模型胞內CFU計數關係的分析

藥物濃度為MIC的Bdq介導Th1因子IL-12/23 p40、TNF-α和Th2因子IL-6、IL-10變化與MDR-MTB感染模型胞內CFU計數關係的分析結果見圖2。從圖中可見:Bdq作用後各時間點IL-12/23 p40和IL-10表達量相接近,不隨胞內CFU計數的變化而變化,但IL-12/23 p40表達量在給藥後4h高於感染組,IL-10表達量則在給藥後24h、48h低於感染組。此外,TNF-α表達量在給藥後24h、48h隨著胞內CFU計數降低而增高,且其表達量在給藥後24h高於感染組(P<0.05)。IL-6表達量隨著胞內CFU計數降低逐漸升高,但均與感染組相接近。

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圖2 藥物濃度為MIC的Bdq介導Th1因子IL-12/23 p40、TNF-α和Th2因子IL-6、IL-10變化與MDR-MTB感染模型胞內CFU計數關係的分析結果

研究意義與展望

本研究首先建立巨噬細胞耐多藥結核分枝桿菌感染模型,觀察貝達喹啉(Bdq)對感染模型的殺菌作用,並探討與其殺菌作用可能相關細胞因子的分泌和表達,為進一步完善Bdq的作用機制提供依據。實驗結果表明:Bdq對胞內耐多藥結核分枝桿菌具有較強的殺菌作用,且具有時間和濃度依賴性。對胞內耐多藥結核分枝桿菌與H37Rv的後期殺菌活性相接近。Bdq可能具有免疫調節作用,在給藥後不同時間點誘導Th1因子IL-12/23p40和TNF-α的高表達、Th2因子IL-10的低表達。

既往研究表明,耐多藥結核分枝桿菌感染可導致宿主體內細胞免疫功能異常,從而導致耐多藥結核分枝桿菌的殺滅、清除受限。本實驗中我們使用耐多藥結核分枝桿菌(臨床編號:24635)感染巨噬細胞後,觀察其殺菌作用與細胞因子的分泌和表達,之後觀察Bdq對MDR-MTB感染模型的殺菌作用及細胞因子的影響,最後探討殺菌作用與細胞因子的關係。然而還有一些問題亟待解決:動物水準是評價藥物療效及作用機制的關鍵一環,接下來會在動物水準探討藥物的殺菌作用與相關細胞因子錶達和分泌的關係。未來應在動物模型上,擴大耐多藥結核分枝桿菌的樣本量和耐藥類型,進一步研究,以獲得更為可靠的研究結果。

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編輯:王    然

審校:郭    萌

發佈日期:2022-05-23

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