不同的腸道微生物群與阿苯達唑-伊維菌素對土傳蠕蟲病的療效相關

本研究表明,腸道微生物群組成是阿苯達唑和伊維菌素驅蟲治療效果的重要驅動因素。

導讀  

經土壤傳播的蠕蟲感染是一個巨大的負擔,世界上超過四分之一的人口處於危險之中。標準治療(阿苯達唑)的治愈率較低;因此,正在研究一種更有效的聯合療法(阿苯達唑和伊維菌素),但顯示出不同的治療效果,沒有證據表明存在內在寄生蟲耐藥性本研究分析了鞭蟲(Trichuris trichiura)和鉤蟲感染患者的微生物群,發現不同的腸型與療效之間存在關聯。來自寮國Pak-Khan地區的80例與鉤蟲共同感染的T. trichiura感染患者接受了阿苯達唑(n=41)或阿苯達唑-伊維菌素聯合治療(n=39)。採用16S rRNA基因測序、qPCR和鳥槍法測序對治療前/後的糞便樣本進行分析,以監測治療效果。我們確定了三種細菌腸型,並表明治療前腸型與聯合治療鞭蟲(CRET1=5.8%CRET2=16.6%CRET3=68.8%)和鉤蟲(CRET1=31.3%CRET2=16.6%CRET3=78.6%)感染的療效相關。本研究表明,治療前腸型可以預測聯合治療鞭蟲和鉤蟲感染的治療結果。

論文ID

名:Different gut microbial communities correlate with efficacy of albendazole-ivermectin against soil-transmitted helminthiases

不同的腸道微生物群與阿苯達唑-伊維菌素對土傳蠕蟲病的療效相關

期刊Nature Communications

IF:14.919

發表時間:2022.2.25

通訊作者:PierreH. H. Schneeberger & Jennifer Keiser

通訊作者單位:瑞士熱帶病與公共衛生研究所;瑞士巴塞爾大學

DOI號:10.1038/s41467-022-28658-1

實驗設計

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結果

抽樣結果和研究特徵。2019年1月至5月間,寮國瑯勃拉邦區Nambak 10個村莊的人接受了T. trichiura檢測。549人被納入並隨機分配到單藥治療(阿苯達唑)或聯合治療(阿苯達唑-伊維菌素)。在第一次給藥後28天內,每天收集88名患者的治療後糞便樣本,其中80名患者被納入微生物組評估(圖1)。其中,86.2%(n=69)與鉤蟲共同感染,40%(n=32)與人蛔蟲(A. lumbricoides)共同感染,8.7%(n=7)與麝貓後睪吸蟲(Opisthorchis viverrini)共同感染。治療組在性別、年齡、寄生蟲的基線感染強度方面保持平衡,組間未觀察到顯著差異(表1)。同樣,治療後期間的採樣依從性在兩個治療組間具有可比性(補充圖1)。43921652312697974 

1 試驗概述 描述用於微生物組分析的患者數量的試驗流程。

1 隊列描述。

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y ,年; ATX ,治療前 1 個月內進行抗生素治療; EPG ,每克糞便中的蟲卵數; SD ,標準差, arit ,算術平均值; geom ,幾何平均值; I.i ,根據世界衛生組織標準確定的感染強度。   

組成聚類和聚類特有的分類特徵。治療前基於分類組成的無監督聚類能夠將潛在的群落結構識別為三個不同的集群或腸型(ET1-3),如圖2A所示。每種腸型所代表的比例在兩個治療組之間具有可比性(補充圖2)。當使用該數據集上的隨機森林模型評估時,這種基於腸型的分類的準確性為78.75%,Kappa統計量為62.93%。就分類準確度而言,最重要的分類特徵包括糞桿菌屬Faecalibacterium(2.704%)、埃希氏菌/志賀氏菌複合體Escherichia/Shigella complex(2.613%)、普雷沃氏菌屬Prevotella(1.814%)、Phascolarctobacterium(1.082%)和[Eubacterium] coprostanoligen group(1.044%)(圖2B)。3種腸型之間差異豐富的8個屬中(圖2C),ET1中Faecalibacterium和Prevotella的相對豐度較高(分別為P=2.61E-09和7.55E-05),ET2中Escherichia/Shigella的相對豐度較高(P=1.33E-07),而[Eubacterium] coprostanoligenes group在ET3中富集(P=7.55E-05)(圖2C)。將來自兩個治療組的樣本與PERMANOVA(r2 = 0.013,P = 0.38)進行比較,分類組成是均質的,如圖2D所示。ET2與ET1、ET3之間的α多樣性比較,顯示Shannon多樣性較低,Berger-Parker優勢指數較高(補充圖3),而ET1與ET3之間差異不顯著。18761652312698114 

圖2 基本組成結構及其分類學特徵。 

A 鞭蟲感染患者治療前腸道微生物群落組成。 使用 Bray-Curtis 相異度生成 cladogram 圖。 

B 使用隨機森林模型在該數據集中的分類性能。 根據個體對樣本分類的貢獻,對分類特徵進行排序。 

C 使用組間比較的 Kruskal-Wallis 檢驗結合線性判別分析效應大小 (Lefse) 發現細菌屬在其中一種腸型中富集。 

D 基於 Bray-Curtis 相異度的基線樣本非度量多維尺度排序圖。 所標記的屬在兩種腸型中均有富集。 治療組 A= 阿苯達唑和伊維菌素,治療組 B= 阿苯達唑, ET 腸型。 特定分類群的絕對豐度和細菌總數證實了不同群落結構的存在。通過qPCR評估Faecalibacterium (FAEC)、Escherichia (ESCH)和Prevotella (PREV)的絕對豐度,證實了基於16SrRNA基因測序的腸型分類(圖3A)。例如,ET2中的ESCH顯著高於ET1和ET3(P = 0.001和0.002)。ET1組中FAEC和PREV均顯著高於ET3組(P = 0.001和P =0.004)。

然後,我們檢測了從這三個目標和總細菌量(16S)獲得的qPCR值是否可用於將樣本劃分為16SrRNA基因測序確定的三種腸型之一。基於qPCR的隨機森林模型將83.1%的樣本(Kappa=0.72)準確分類為腸型1-3,這與基於測序的分類得到的指標相似。該模型的受試者工作特徵曲線下面積(AUC)在ET1和ET2之間為1(95%CI:NA),在ET1和ET3之間為0.88(95%CI:0.79-0.97)和在ET2和ET3之間為0.91(95%CI:0.82-1)(圖3B),表明基於qPCR的分類作為高通量測序的替代方案適用於已確定的腸型。 已確定的腸型與鞭蟲和鉤蟲治愈之間的聯繫。對於接受阿苯達唑單藥治療的鞭蟲(圖4A,右半圖)或鉤蟲感染(圖4B,右半圖)患者,我們沒有觀察到任何治愈率(定義為治療後第14-28天內,每克糞便中的蟲卵數(EPG)為零)與ET之間的關聯。然而,大多數接受聯合治療(阿苯達唑-伊維菌素)並治愈兩種STH感染的患者,其腸道微生物組成被歸類為ET3治療前。這種觀察結果與鞭蟲(圖4A,左半圖)和鉤蟲感染(圖4B,左半圖)相似。與基線ET3患者相比,鞭蟲感染治愈的可能性顯著降低(P=0.0002),優勢比(OR)為0.03(95%CI: 0.01-0.2)。在ET1/ET3和鉤蟲治療結果之間觀察到類似的,儘管相關性較弱(P=0.025),OR為0.14(95% CI: 0.03-0.66)。我們以90%的蟲卵減少率(ERR)進行了類似的分析,作為對治療結果的估計。在聯合治療組中,我們發現兩種感染的腸型和ERR之間存在顯著的相關性,類似于腸型和治愈率之間的相關性(補充圖4)。對於接受單藥治療的患者,我們沒有發現腸型和ERR之間的任何關聯。測定的基線PREV和FAEC絕對豐度與聯合治療後第14至28天的平均蟲卵數相關,Spearman相關係數分別為0.416(P=0.009)和0.275(P=0.09)(補充圖5A)。在單藥治療組中沒有觀察到T. trichiura治愈與微生物絕對豐度之間的相關性,在兩個治療組中也沒有觀察到鉤蟲治愈與微生物絕對豐度之間的相關性(補充圖5B-D)。 在阿苯達唑-伊維菌素治療組中,失敗或成功相關腸型中富集物種水準特徵。為了確定失敗相關腸型1-2與成功相關腸型3之間的物種水準差異,我們從阿苯達唑-伊維菌素治療組收集的樣本中生成鳥槍法測序數據。除了先前觀察到的來自Prevotella(ET1中的P. copri)、Faecalibacterium(ET1中的F. prausnitzii)、Escherichia/Shigella(ET2中的大腸桿菌)和瘤胃球菌Ruminococcus(ET3中的R. torques)的富集特徵外,當兩組進行比較時,我們發現唾液鏈球菌(Streptococcus salivarius)、Coprococcus eutactus、Roseburia faecis、Dorea longicatena和Eubacterium halii在ET1或ET3中顯著富集(圖4C)。當ET3與ET2比較時,Coprococcus eutactus在ET3中也減少,而Anaerostipes hadrus則在ET3中富集。15121652312698424 

3 分類特異性和總細菌 qPCR 將治療前樣本分類為與治療相關的類別。 

A 用定量 PCR(qPCR) 檢測總細菌和分類群特異性密度,按腸型分類。 採用 Mann-Whitney 檢驗比較腸型 1(n=17) 、腸型 2(n=6) 和腸型 3(n=16) 的絕對豐度。 每個框的下限和上限分別代表 第一四分位數 和 第三四分位數 ,其中的線表示中位數。 線段表示最小值和最大值。 

B 使用 qPCR 值進行腸型分類的敏感性和特異性。 PREV , Prevotella 屬 qPCR 靶標; FAEC , Faecalibacterium 屬 qPCR 靶標; ESCH , Escherichia coli qPCR 靶標; 16S ,總細菌 qPCR 靶標。   80801652312698518 

4 土壤傳播的蠕蟲治愈與治療前腸型(ET)之間的關聯以及每種腸型的物種水準特徵。

A鞭蟲感染治療結果與基線ET之間的關聯。B治療前測定鉤蟲治療結果與ET的相關性。治愈率定義為治療後14至28天期間糞便中是否有蟲卵(=治療後第14至28天期間收集的樣本中每克糞便中的平均蟲卵數)。

B腸型之間的物種水準差異。Fisher雙側精確檢驗,括弧中顯示優勢比的95%置信區間。餅圖上的標簽表示每組的患者人數。n,患者數量;OR,優勢比。 按治療前腸型分層的治療結果的Cox比例風險模型。

在治療後28天的兩個連續樣本中沒有檢測到蟲卵被定義為鞭蟲感染治愈,測定的風險比表明,與ET1相比,接受聯合治療的患者在出現ET3時蟲卵清除速度更快(HR=18.12,P=0.005)。當調整諸如性別、年齡和感染強度等潛在的混雜因素時,這種關聯仍然成立(表2)。與ET1患者的蟲卵清除率相比,ET3患者的鉤蟲治療也觀察到更快的清除率(HR=3.75,P=0.016)。在調整性別(P=0.04)、年齡(P=0.003)、感染強度(P=0.017)和基線EPG(P=0.039)後,這種相關性仍然成立。在聯合治療組中,出現ET2和ET1的鞭蟲和鉤蟲感染患者早期蟲卵清除率沒有差異。在單藥治療組中,我們沒有觀察到腸型與治愈率之間的任何聯繫。單藥治療組中治療前/治療後EPG計數強烈相關,但在聯合治療組中不相關,這與觀察到的治療效果一致(補充圖6)。 成功和失敗相關腸型與每日治療後每克糞便中蟲卵計數的相關性。通過生存分析,我們證實使用阿苯達唑和伊維菌素治療,出現ET3的患者比出現ET1和ET2的患者更有可能更快、更有效地治愈鞭蟲感染(P=0.0002;圖5,左圖)。同樣的觀察結果也適用於鉤蟲感染(P=0.009;圖5,右圖)。觀察到對鞭蟲感染的總療效為33.3%。ET1患者ET特異性療效為5.8%,ET2患者為16.6%,ET3患者為68.8%。對鉤蟲的總療效為47.2%。ET3患者在治療後14天的CR最高,為78.6%,而ET1和ET2患者在該時間段內分別只有31.3%和16.6%的治愈率。每日的蟲卵模式也很大程度上反映了這些結果(圖5B)。無論治療組或基線腸型如何,治療後立即觀察到EPG計數急劇下降。對於鞭蟲EPG計數,聯合治療組(5天平均EPG為98.2%)比單藥治療組(5天平均EPG為72.9%)下降更明顯,這與在提出的隨訪檢查(14-28天)中觀察到的聯合治療的療效增加有關。值得注意的是,在兩種感染類型中,ET1患者的EPG計數在最初下降後增加,ET2患者的EPG計數在較小程度上下降。比較不同治療組間鉤蟲EPG計數下降沒有差異,聯合治療和單藥治療在第5天的平均下降分別為99.1%和99.3%。

2 使用治療前(pre-Tx)腸型(ET)預測蟲卵清除時間。

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清除 定義為連續兩個樣本沒有檢 測到蟲卵 ( 鞭蟲或鉤 蟲 ) ,並且在第 14 至 28 天之間的平均蟲卵 計數為零。 高於 1 的顯著風險比表明患者正在以更快的速度到達事件 ( 清除蟲卵 ) 。 ALB-IVE ,阿苯達唑 - 伊維菌素, ALB ,阿苯達唑; ref. ,參考類別; HR(95% CI) ,風險比 (95% 置信區間 ) ; T x ,治療。97811652312699246 

治療前腸型與治療後鞭蟲和鉤蟲每日蟲卵數的關係。

A Kaplan-Meier曲線顯示隨時間推移感染患者的剩餘比例,按基線腸型分層。鞭蟲治療在左邊,鉤蟲治療在右邊。

B按治療前的腸型分層,鞭蟲(上兩圖)和鉤蟲(下兩圖)的日平均蟲卵數。每日蟲卵計數顯示為聯合治療(阿苯達唑和伊維菌素;左半圖)和單藥治療(阿苯達唑;右半圖)。黑色虛線表示每種寄生蟲中度感染的下限和上限。ND,未檢測出;post-tx,治療後;ALB,阿苯達唑;IVE,伊維菌素。

利用KEGGorthology術語(KO)對這三種腸型進行功能分析,結果顯示,三種腸型共用了大量的KO(n=3823或80.8%;圖6A)。ET3特有KO比例最高(4.4%),其次是ET1(2.6%)和ET2(1.4%),表明ET3的功能多樣性最高,而以大腸桿菌為主的ET2的功能多樣性最低。但在數量上,ET3和ET2之間的每百萬基因拷貝數變異(27.2%KO差異顯著)高於ET3和ET1之間的變異(0.96%KO),表明儘管存在明顯的分類學差異,但ET3和ET1之間存在功能冗余(圖6B)。使用PERMANOVA進行比較時,在群落水準上觀察到不同腸型之間的顯著差異(圖6C)。但與失敗相關的ET1和成功相關的ET3(R2 =0.073, P =0.009)相比,ET2與ET1和ET3的R2分別為0.338(P =0.001)和0.347 (P =0.001),差異更為顯著。在圖6D中,我們發現腸型和參與遺傳資訊處理、代謝以及信號傳導和細胞過程的KO之間的高水準群落代謝潛力相似,佔所有腸型已識別通路的80%以上。我們發現以前與文獻中陽性STH感染狀態相關的特定通路中,腸型之間存在顯著差異。例如,與ET3相比,在失敗相關的ET1和ET2中三條通路包括甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、原核碳固定以及花生四烯酸代謝顯著富集(圖6E,補充圖7中提供了豐度差異通路的完整列表)。

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6 腸型間代謝潛能的比較。

A維恩圖顯示了治療相關腸型之間KO術語的定性重疊。

B熱圖突出顯示不同腸型之間KO水準的數量差異(標準化計數的差異)。使用Deseq2進行比較,並採用Benjamini-Hochberg程式對p值進行多重檢驗偏差校正。

C利用主成分分析顯示KO在群落水準上的差異。為了量化這些差異,我們進行了PERMANOVA分析。

D柱狀圖顯示高水準KEGG通路的平均相對豐度,按腸型劃分。為了清晰起見,只顯示了大於2%的序列比例。

E以往研究中與陽性土傳蠕蟲感染狀態相關的代謝通路相對豐度的腸型比較。採用Kruskal-Wallis檢驗結合Benjamini-Hochberg多重檢驗偏差校正來識別差異,計算倍數變化以顯示相應的效應大小。ET1-3,腸型1-3;FC,倍數變化;Ref.,參考。

討論

本研究首次調查了用於治療人類鞭蟲和鉤蟲感染的基本藥物治療失敗的腸道微生物決定因素。我們的結果代表了我們對驅蟲治療背景下腸道微生物-藥物相互作用的理解有了重大改進。主要發現是(i)在這種情況下,在特定分類群的相對豐度和絕對豐度方面發現了分類學上不同的群落,(ii)治療前群落組成或腸型與阿苯達唑-伊維菌素聯合治療鞭蟲和鉤蟲感染的治療結果有關。這些觀察結果表明,在使用以伊維菌素為基礎的治療時,糞便樣本的治療前微生物組成與鞭蟲和鉤蟲的治療效果密切相關。 伊維菌素是一種功能和化學性質複雜的藥物。例如,最近的文獻描述了該藥物的重新定位以治療廣泛的未被臨床試驗認可的非寄生蟲病。因此,這可能導致全球伊維菌素消費量的增加,事實上,了解伊維菌素與腸道微生物群的相互作用對公共衛生健康更加重要。此外,該藥物含有一個16-元大環內酯基團,其結構類似于重要的大環內酯類抗生素,如紅黴素(14-元內酯)、阿奇黴素(15-元內酯)、酪氨酸/交沙黴素(16-元內酯)等。雖然這仍有待在功能上進行驗證,但它提出了一個問題,即細菌和伊維菌素之間是否可能發生耐藥性相互作用,從而導致藥物失活,這可能是通過藥物對失敗相關類群潛在的抑菌殺菌活性來驅動的。進一步的研究應該調查這一直接機制,因為一些與失敗相關的分類群是革蘭氏陽性菌,它們是大環內酯類抗生素的已知靶標,因此可能對該藥物敏感。耐藥性並不是唯一的可能性,最近在唾液鏈球菌(S. salivarius)中描述的一種機制,即藥物在細菌細胞中的生物隔離也可能導致治療效果下降。最後,群落水準的代謝潛能可能是另一種潛在的相互作用機制。目前,關於腸道微生物群和蠕蟲定殖相互作用的數據相當缺乏,主要來源是使用高通量測序方法比較感染和非感染患者的代謝組成的觀察隊列。在這項研究中,我們強調了在代謝通路豐度方面的群落特異性差異,這反過來又可能與治療結果有關。

雖然評估因果關係將需要後續研究,但我們表明,本研究中確定的三種治療相關腸型的代謝潛力存在顯著差異。對於與其他兩種腸型ET1和ET3表現出深刻差異的失敗相關的ET2來説尤其如此。此外,我們發現,與ET3(之前與陽性STH感染狀態相關)相比,兩種失敗相關表型中均有一些特定的通路富集。雖然這還有待進一步驗證,但我們可以假設,某些微生物組成和相關的代謝特徵可以為定殖的寄生蟲提供或多或少的許可環境,並導致驅蟲治療的效果受到調節。值得注意的是,這種微生物組-藥物相互作用存在於定殖小腸的鉤蟲以及位於大腸開始處的盲腸中的鞭蟲。這有利於更廣泛的相互作用,而不是局限于局部的活動。未來研究的另一個重點還包括了解在34-86%對阿苯達唑/伊維菌素治療無反應的患者中,有多少可以歸因于潛在的細菌驅動的相互作用。這些資訊將有助於確定如何通過基於微生物群的治療來改善治療反應。 這項研究的另一個重要意義是,作為抗寄生蟲藥物銷售的伊維菌素也可能有助於選擇交叉耐藥的細菌分離株,這可能會阻礙抗生素管理項目的努力。這一點尤其重要,因為它廣泛用於MDA活動。如果這種耐藥性相互作用在功能上得到驗證,伊維菌素和相關衍生物莫西菌素也應該被考慮在抗菌管理工作中。這可以通過對耐藥性的遺傳/表型決定因素進行治療前篩選來實現。 然而,本研究有幾個重要的局限性。首先,我們的觀察是基於樣本量相對較少的隊列(n=80)和有爭議的腸型概念。在實踐中,這意味著我們在本研究中提出的基於β-多樣性的腸型分類可能會在未來的研究中發生改變。此外,在這種情況下確定的失敗的分類決定因素可能是特定於寮國的PakKhan村,可能是無法推廣的。雖然我們用不同的技術證實了我們與分類學相關的觀察結果的穩健性,但還需要在不同的環境下進行進一步的研究,以確定低阿苯達唑-伊維菌素治療效果的常見微生物/遺傳因子。其次,我們沒有研究內在的蠕蟲抗藥性。雖然目前尚無已知的篩選鞭蟲和鉤蟲對伊維菌素耐藥性的靶標,但我們不能排除寄生蟲敏感性較低可能部分解釋治療效果降低的原因。雖然這是可能的情況,但我們與療效相關的觀察結果(66.7%失敗)與之前關於該藥物聯合治療失敗的觀察結果一致。由於迄今為止沒有證據表明人類對伊維菌素産生了寄生蟲抗藥性,因此我們認為該研究環境代表了具有正常寄生蟲敏感性的環境。 

綜上所述,本研究表明,腸道微生物群組成是阿苯達唑和伊維菌素驅蟲治療效果的重要驅動因素。這些發現將有助於了解基於阿苯達唑和伊維菌素的治療在很大一部分患者中失敗的原因,同時仍是成功治療STH感染的最有效選擇之一。這將有望帶來基於調節失敗相關特徵的新治療機會,也許更重要的是優化這些強效藥物的循證使用。

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