CRISPR-Cas9基因編輯在阿爾茨海默病中的應用前景

阿爾茨海默病(AD)是一種進行性、不可逆的神經退行性疾病,臨床表現為認知障礙、行為異常和社會缺陷。

來源 | 小藥説藥

阿爾茨海默病(AD)是一種進行性、不可逆的神經退行性疾病,臨床表現為認知障礙、行為異常和社會缺陷。據預測,到2050年,美國65歲及以上老年癡呆症患者的數量可能會達到1380萬。在中國,超過1507萬60歲或以上的老年人患有癡呆症,其中約983萬人患有AD。

目前,AD的發病機制還不清楚。β-澱粉樣蛋白沉積tau蛋白過度磷酸化被廣泛認為是AD發病的神經生物學機制。此外,其他年齡相關、保護性和疾病促進因素可能與AD的核心機制相互作用,並可能參與AD的發病。

近年來,CRISPR/Cas9的基因編輯技術發展迅速,在基礎研究和疾病治療領域顯示出巨大的潛力。最近,基因編輯技術被評估為AD研究和治療的一種有前途的方法。CRISPR/Cas9在AD模型構建、致病基因篩選和靶向治療等方面具有極大的應用潛力

CRISPR/Cas9系統

CRISPR/Cas9系統本質上是一種針對外源DNA的細菌防禦機制。CRISPR最初發現于20世紀80年代末,是一種由交替重復和非重復DNA序列組成的不尋常的遺傳結構。基因組分析表明,CRISPR和Cas蛋白作為獲得性免疫系統發揮作用,並通過RNA引導的DNA切割系統保護原核DNA免受噬菌體和質粒DNA的攻擊。

當外源DNA侵入細菌時,其DNA片段作為間隔子併入CRISPR位點。然後將該位點轉錄到CRISPR前RNA(crRNA),該RNA附著到組成性形成的反式激活RNA(tracrRNA)上,由CRISPR相關蛋白修飾成gRNA。當gRNA與非活性Cas9複合物的REC I結構域結合時,該複合物被激活,導致gRNA及其互補單鏈DNA形成異源雙鏈。Cas9的HNH和RuvC核酸酶域隨後分別切割互補和非互補DNA鏈。

Cas9屬於1類CRISPR-Cas系統的II型,來源於化膿鏈球菌。Cas9與靶序列的偶聯需要一個原間隔基鄰近基序(PAM),一個小的入侵基因組中的3-8bp DNA序列,PAM在區分細菌自身和非自身DNA以及成功結合Cas9方面至關重要。

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與ZFN和TALEN不同,ZFN和TALEN依賴於每個特定基因序列的精細蛋白質産物,CRISPR/Cas9系統依賴於gRNAs,使其成為更靈活的平臺。Cas9蛋白保持不變,而gRNA可以方便地根據每個基因進行定制。CRISPR/Cas9系統的另一個優點是,它使得在多個基因座上同時進行基因編輯成為可能,與以前的系統相比,它提供了一個更高效和可擴展的平臺。

CRISPR/Cas9應用於AD模型的構建

細胞模型由於不涉及倫理問題,實驗週期相對短,成本低,因此在包括AD在內的各種神經疾病的研究中得到了廣泛的應用。在過去的幾十年中,建立了許多AD的體外細胞模型。迄今為止,AD研究中常用的細胞係包括人類神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y和SK-N-SH、小鼠海馬神經元細胞係HT22和膠質細胞BV2以及小鼠膠質母細胞瘤細胞N2a。CRISPR/Cas9基因編輯技術的出現可以促進更有效地開發AD細胞模型。

例如,通過CRISPR/Cas9系統下調HT22細胞中硫氧還蛋白相互作用蛋白(Txnip)水準可有效減弱β-澱粉樣蛋白誘導的蛋白質半胱氨酸氧化修飾。研究結果表明,Txnip可能是治療AD的一個治療靶點。

除了構建AD細胞模型外,CRISPR/Cas9技術還可用於構建AD動物模型。2020年,Serneels等人通過使用CRISPR/Cas9策略在小鼠和大鼠的APP基因中生成人源化aβ序列(G676R、F681Y和R684H),創建了一個名為Apphu/hu的新模型。通過在嚙齒類動物Aβ序列中插入三種氨基酸,Aβ的水準比原始野生型增加了三倍以上。

CRISPR/Cas9應用於AD致病基因的篩選

阿爾茨海默症分為散發性(SAD)和家族性(FAD)。APP、PSEN1和PSEN2是引起FAD的主要致病基因,每個基因的突變都可能導致FAD的發生。然而,95%以上的AD病例是散發性的,SAD致病基因的篩選對於了解AD的分子發病機制、早期診斷、風險預測和治療至關重要。

高通量測序和CRISPR/Cas9的發展為SAD致病基因的篩選提供了很大的幫助。例如,研究發現,通過CRISPR系統敲除IPSC中的TREM2,小膠質細胞的存活、載脂蛋白E的清除和SDF-1α/CXCR4介導的趨化性都受到嚴重影響,最終導致對β澱粉樣斑塊的損傷反應。此外,Duan等人設計了基於成像的陣列CRISPR,用於研究與AD特徵相關的基因。這也將提供一個探索AD生物學的平臺和藥物發現的機會。

CRISPR/Cas9應用於AD的靶向治療

CRISPR/Cas9靶向APP基因突變

APP基因的突變導致Aβ前體蛋白的β-分泌酶切割增加,從而導致顯性遺傳性AD。Gyorgy等人報告,當使用CRISPR/Cas9技術敲除APP等位基因時,Aβ蛋白的表達降低。因此,CRISPR/Cas9系統可能為具有APP突變的AD患者提供基因治療策略。

CRISPR/Cas9靶向Aβ蛋白的關鍵酶

Aβ蛋白是通過BACE1和γ-分泌酶對APP進行順序修飾形成的。因此,靶向BACE1和γ-分泌酶是治療AD的一種潛在治療策略。Park等人報告,在兩種AD小鼠模型中,通過使用CRISPR/Cas9成功降低了BACE1的表達。γ-分泌酶由γ-分泌酶激活蛋白(GSAP)調節,Wong等人利用CRISPR-Cas9技術在穩定表達APP的HEK293細胞中敲除GSAP,導致Aβ分泌和γ-分泌酶活性顯著降低。

CRISPR/Cas9靶向編輯載脂蛋白E基因型

APOE4亞型是SAD最強的遺傳風險因素。眾所週知,APOE主要由中樞神經系統的星形膠質細胞表達。Wadhwani等人關於APOE4治療靶點的研究表明,當通過CRISPR/Cas9方法將兩名AD患者的IPSC中的E4等位基因更正為E3/E3基因型時,E3神經元對離子黴素誘導的細胞毒性不太敏感,並且表現出tau磷酸化的降低。此外,Lin等人利用hiPSC和CRISPR/Cas9技術鑒定了APOE4的功能,他們的結果表明APOE4以不同的方式影響Aβ代謝。這些發現表明APOE4可能是治療AD的一個有希望的靶點。

CRISPR/Cas9靶向促炎分子

人類基因關聯研究表明,免疫反應也是AD病因的主要途徑。越來越多的證據表明慢性神經炎症在AD中的重要性。CD33是一種免疫調節受體,在中性粒細胞上高水準表達,在小膠質細胞上低水準表達,在調節AD病理學的吞噬功能方面具有不同的作用。Bhattacherjee等人的最新研究表明,通過CRISPR/Cas破壞CD33基因,並替換為hCD33的保護性變體,可以減輕Aβ病理和神經退行性變。

膠質成熟因子(GMF)是一種新發現的促炎症分子,主要在澱粉樣斑塊周圍的反應性膠質細胞中表達,並在各種AD腦區高度表達。GMF的過度表達通常通過激活p38 MAPK信號通路和氧化毒性導致神經細胞死亡。Raikwar等人通過CRISPR/Cas9方法成功降低BV2細胞中的GMF表達,從而抑制pp38 MAPK以調節GMF誘導的小膠質細胞促炎症反應。

半胱氨酸白三烯(Cys-LTs)是一組炎症脂質分子,通過兩種主要的G蛋白偶聯受體(CysLT1R和CysLT2R)啟動炎症信號級聯反應。近年來,越來越多的證據表明CysLT1R與AD的發生和發展密切相關,並可通過NF-κB途徑介導炎症反應。Chen等人證明,通過CRISPR/Cas9系統刪除CysLT1R可減少APP/PS1小鼠的澱粉樣病變並減輕神經炎症。

小結

基因編輯由於其在科學研究和疾病治療中廣泛而有效的應用前景,近年來進入了一個蓬勃發展的時期。最近,已有許多關於CRISPR/Cas9介導的AD相關研究,主要涉及利用該技術構建AD模型、篩選致病基因以及通過特定靶基因(如APP、BACE1、APOE4、CD33、GMF和CysLT1R)治療AD。然而,考慮到該技術中潛在的非靶向錯配和特異性組織靶向性,CRISPR-Cas9最終應用於AD的臨床治療仍面臨諸多挑戰。

總之,CRISPR/Cas9作為本世紀的基因編輯技術的突破性進展,為臨床基因治療開闢了新的途徑。與其他基因編輯技術相比,CRISPR-Cas9系統具有週期短、細胞毒性低、價格低廉、傳遞簡單等優點。因此,儘管考慮到仍存在一些缺點,CRISPR-Cas9系統在AD的臨床治療中仍具有廣闊的應用前景。

參考文獻

1. Application of CRISPR/Cas9 in Alzheimer’sDisease. Front Neurosci. 2021; 15: 803894.

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