益生菌給藥增強抗PD-1抗腫瘤治療效果(國人佳作)

Probio-M9與ICB治療協同作用,顯著抑制了腫瘤,還能有效恢復被抗生素破壞的糞便微生物群。

編譯:微科盟九卿臣,編輯:微科盟茗溪、江舜堯。

微科盟原創微文,歡迎轉發轉載,轉載須註明來源《微生態》公眾號。

導讀  

免疫治療是對多種惡性腫瘤進行科學研究和臨床治療的一種較新的方法。其中免疫檢查點阻斷(Immune checkpoint blockade,ICB)是通過激活T淋巴細胞介導的免疫應答來提高腫瘤的免疫監測。腫瘤微環境中的免疫檢查點抑製劑(Immune checkpoint inhibitors,ICIs)通過拮抗T細胞上的負調節因子來抑制腫瘤細胞的免疫逃逸。然而,由於患者之間的個體差異,只有少數患者從ICIs中獲益。抗生素攝入往往導致治療的不良結果和免疫應答低效,而ICB成功用於腫瘤治療的證據表明療效與宿主的腸道菌群有關。外源性益生菌的應用可能是提高ICB療效的一種有前景的方法。然而益生菌與ICIs在腫瘤抑制中的協同作用似乎具有菌株特異性,因此有必要評估單個候選益生菌菌株在ICB治療中的療效。

本研究旨在評估鼠李糖乳桿菌Probio-M9在恢復被抗生素破壞的腸道菌群及其對荷瘤小鼠ICB治療的效果。首先用抗生素破壞小鼠腸道菌群,然後經益生菌調節或自然恢復,隨後是基於PD-1的抗腫瘤治療。在實驗不同階段監測糞便宏基因組及抑瘤效果的變化。結果表明,和未接受益生菌的組相比,Probio-M9協同ICB治療顯著抑制了腫瘤增長(P<0.5)。協同作用還能有效恢復被抗生素破壞的糞便微生物群,其特徵是Shannon多樣性值大幅降低,優勢類群組成發生變化。此外,益生菌的使用顯著增加了有益菌的相對豐度(0.0001<P<0.05)。腸道菌群的變化伴隨著功能性宏基因組的輕度重塑,其特徵是糖降解、維生素和氨基酸合成途徑的富集。綜上所述,本研究認為Probio-M9可作為未來基於微生物協同腫瘤治療研究的候選菌株。獲得的數據將支援未來人體臨床試驗的設計,並評估益生菌輔助治療在ICB治療中的安全性。

 論文ID

 名:Adjunctive probiotic Lactobacillus rhamnosus Probio-M9 administration enhances the effect of anti-PD-1 antitumor therapy via restoring antibiotic-disrupted gut microbiota

輔助益生菌鼠李糖乳桿菌Probio-M9給藥通過恢復抗生素破壞的腸道微生物群增強抗PD-1抗腫瘤治療的效果

期刊Frontiers in Immunology

IF:7.561

發表時間:2021.12.14

通訊作者:張和平、孫志宏

通訊作者單位:內蒙古農業大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室

DOI號:10.3389/fimmu.2021.772532

實驗設計

本實驗採用CT26.WT結直腸癌細胞係和SPF級balb/c小鼠構建荷瘤動物模型。小鼠隨機分為4組:藥物對照組(MC)、聯合治療組(CT)、單獨使用益生菌組(PA)和陰性對照組(NC;每組9隻)。實驗分為4個階段:抗生素處理、益生菌干預、腫瘤生長和抗PD-1免疫治療。在實驗的不同階段監測糞便宏基因組的變化及抑瘤效果。隨後用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit 提取糞便總DNA,建庫後對150 bp長度進行正反向測序。接下來使用KneadData進行reads品質控制,並使用Bowtie2去宿主DNA,經過過濾得到881.88 Gbp的高品質數據。

96831640906332499

圖1 實驗設計示意圖(原文中圖1A)。

前言

免疫治療是通過免疫檢查點阻斷(ICB)來實現的,它激活T淋巴細胞介導的免疫反應來改善腫瘤的免疫監測。腫瘤微環境中的免疫檢查點抑製劑(ICIs)通過拮抗T細胞上的負調控因子來抑制腫瘤細胞的免疫逃逸。這類分子包括細胞毒性T淋巴細胞相關抗原-4(CTLA-4)、程式性死亡受體1(PD-1)和程式性死亡配體1(PD-L1),是目前臨床應用於ICB治療的三個主要靶點。

ICB療法已成功應用於實體瘤的臨床治療,如黑色素瘤、腎細胞癌、非小細胞肺癌、DNA錯配修復缺失型結直腸癌等。部分患者免疫治療後緩解率顯著改善。然而,由於患者之間的個體差異,只有少數患者受益於ICIs。研究支援ICB的療效與宿主腸道菌群的特徵相關。抗生素使用後腸道失調和有益微生物亞群的急劇減少損害了小鼠和患者的癌症治療效果。因此,可以通過益生菌、益生元、後生元等飲食干預和糞菌移植等管理方法對腸道菌群進行靶向調節,促進ICB的療效。雙歧桿菌和Akkermansia muciniphila可通過促進樹突狀細胞的抗原呈遞來增強宿主對ICB治療的免疫應答。鼠李糖乳桿菌GG可以提高小鼠的抗腫瘤免疫力。這些結果支援了使用外源性益生菌可能是提高ICB療效的一種方法。益生菌與ICIs對腫瘤抑制的協同作用似乎有菌株特異性;因此,有必要評估單個益生菌株在ICB治療中的療效。

鼠李糖乳桿菌Probio-M9可能是通過恢復腸道菌群來抑制結腸炎相關的致癌作用。我們假設,基於抗PD-1的抗腫瘤治療的療效需要完整的宿主腸道菌群,證實益生菌可以恢復由外部刺激引起的腸道菌群破壞。因此,本研究旨在評估該菌株對抗生素破壞的腸道菌群的恢復效果,以及其對異位結腸直腸癌體內模型中ICB治療效果的影響。

結果

1 Probio-M9提高了抗PD-1免疫治療的療效

第24天,CT組腫瘤最小(1681.02±77.86 mm3),其次為MC組(2511.05±83.64 mm3),PA組(2867.67±144.60 mm3),NC組腫瘤體積最大(3695.74±134.39 mm3,圖2B)。與其他組相比,抗PD-1治療顯著降低了腫瘤體積(第24天P<0.05),無論是否補充益生菌,抗PD -1治療均有效抑制腫瘤。在任何監測時間點,PA組與NC組腫瘤體積無顯著差異,Probio-M9單獨作用對腫瘤抑制不顯著。補充益生菌增強了抗PD -1治療的抗腫瘤效果(第14天CT組和MC組 538.63±24.03和807.29±24.03 mm3, P =0.014;第18天1087.22±53.67和1371.28±47.01 mm3, P=0.258;第24天1681.02±77.86和2511.05±83.64 mm3, P=0.014),表明在第一次抗PD -1抗體注射後4天就出現了協同作用(圖2B)。

與抑制腫瘤體積效果一致,CT組存活率最高(77.8%,PA組33.3%,MC組22.2%,NC組0%;圖2C);而MC組的存活率僅略高於NC組,表明部分荷瘤小鼠的生存需要益生菌的協同抑瘤作用(圖2C)。

28901640906332690

圖2 宿主菌群調控對PD-1抗體抗腫瘤治療的影響。(B)CT26腫瘤生長動力學和(C)四組小鼠存活率。Wilcoxon檢驗有顯著性差異顯示(P<0.05)。數據以平均值±SEM表示(n = 9)(原文中圖1B, C)。

  2 宏基因組學揭示了抗生素和益生菌治療後腸道菌群的變化

為評估不同處理下腸道菌群的動態變化,對162隻小鼠糞便樣本進行宏基因組測序【6個採樣時間點×3組(CT、MC、NC)×每組9隻小鼠】。PA組採集的糞便樣本不進行宏基因組測序,與NC組相比,其抑瘤效果不顯著(表1)。

Shannon多樣性無顯著性差異,PCoA評分圖未見明顯的分組聚類模式(圖3A),説明在任何治療開始前,組間整體菌群多樣性和結構均無明顯差異。抗生素治療兩周後,與基線相比,Shannon指數下降(P<0.001),而Bray-Curtis距離顯著增加(Adonis試驗,P<0.001),表明抗生素破壞了腸道菌群的多樣性和結構(圖3B)。之後對各組小鼠進行益生菌干預或自然恢復被抗生素破壞的腸道菌群。第24天,各組的Shannon多樣性指數恢復到基線水準,而只有CT組腸道菌群結構與基線相比有顯著差異,MC組和NC組均無差異(Adonis檢驗,P<0.018;圖3C和圖S1),説明腸道菌群可以在沒有外界干預的情況下自然恢復,Probio-M9干預對腸道菌群的調節與自然恢復不同。

給予抗生素和益生菌後,糞便微生物群組成也發生了變化。腸道菌群的主要成分為Muribaculaceae bacterium DSM 103720(22.86%到30.78%), Lactobacillus murinus(15.25%到18.42%)和 Prevotella(14.48%到34.59%)。抗生素處理極大消除了原來的優勢類群,使Escherichia coli,Enterococcus gallinarum和Bacteroides在菌群中佔據優勢(這三個類群在每組中所佔的總比例為>51.87%)。在第24天,大多數類群的相對豐度恢復到原來水準(圖3D和表S1)。

16161640906332827

圖3 腸道菌群多樣性、結構和組成的動態變化。腸道菌群的Shannon多樣性指數和主坐標分析(A)基線時,(B)抗生素治療後,(C)干預結束時。MC,藥物對照;CT,聯合治療;NC,陰性對照(NC)。組標簽後的數字代表對應的採樣時間點(1:-28天,2:-14天,6:24天。(D)MC組、CT組和NC組在-28天、-24天和24天的糞便微生物組成(分別表示抗生素和益生菌治療前和抗PD -1靶向治療結束時的時間點)。T檢驗和Adonis檢驗評價組間差異(原文中圖2)。

 表1 宏基因組測序各樣本數據量。

86481640906334671

MC,藥物對照;CT,聯合治療;NC,陰性對照。

  3 抗生素、Probio-M9和抗PD -1治療對關鍵敏感細菌種類的影響

為了進一步分析抗生素或益生菌對小鼠腸道菌群組成的影響,隨後確定了對這些治療有顯著差異反應的豐富物種。總體而言,對抗生素處理反應顯著的物種有13種,其中A. muciniphila, Bacteroides vulgatus, Enterococcus gallinarum和Escherichia coli的相對豐度顯著增加,其他物種的相對豐度顯著降低(P < 0.05,圖S2A,B)。

抗生素治療後,腸道菌群自然恢復或益生菌干預兩周。CT組六種細菌(Bacteroides vulgatus, Citrobacter amalonaticus, Clostridium sp. ASF502, Escherichia coli, Muribaculaceae bacterium DSM 103720和Prevotella sp. MGM2)的相對豐度顯著高於其他兩組(MC,NC; P<0.05),Clostridium sp. ASF502, Muribaculaceae bacterium DSM 103720和Prevotella sp. MGM2的比例僅在Probio-M9灌胃後第-14天到第0天有所增加(P<0.05)。在沒有Probio-M9的另外兩組中沒有觀察到這種趨勢(圖S2C,D)。此外,Probio-M9處理使B. pseudolongum的相對豐度增加了136倍,而A. muciniphila的相對豐度減少了12倍,但它們的變化無統計學意義(B. pseudolongum P=0.078,A. muciniphila P=0.068;圖S2D)。這些結果表明,腸道菌群對Probio-M9處理的反應存在很大的個體差異,但一些菌種如A. muciniphila 和 B. pseudolongum對大多數小鼠的治療都有反應。

由於益生菌而非抗生素,物種的數量發生了顯著變化,即在抗生素治療後無顯著變化,但在第0天至第24天的相對豐度發生了顯著變化。Bacteroides intestinalis, Bacteroides xylanisolvens, B. pseudolongum, Clostridium sp. ASF502, Lachnospiraceae bacterium A2和Parabacteroides distasonis  CT組明顯多於MC組或NC組(圖4A;0.0001<P <0.05),而在Bacteroides faecichinchillae, Bacteroides thetaiotaomicron, Prevotella sp. MGM1, Mucispirillum schaedleri, Clostridium sp. ASF356和Lachnospiraceae bacterium A4中出現相反趨勢(圖4B; 0.001<P <0.05)。Bacteroides faecichinchillae, Bacteroides intestinalis, Bacteroides thetaiotaomicron, L. bacterium A2, L. bacterium A4和 P. distasonis的相對豐度在腫瘤生長和治療過程中存在顯著變化(圖4C)。

14521640906334782

圖4 Probio-M9對關鍵微生物物種的特異性調控。添加Probio-M9後,物種數量顯著增加(A),減少(B)。(C)干預後物種變化顯著。分組:藥物對照(MC)、聯合治療(CT)、陰性對照(NC)。誤差柱代表SEM。* 代表P < 0.05;* * 代表P< 0.01;* * *代表P < 0.001(原文圖3)。

  4 抗生素、Probio-M9和抗PD -1治療對腸道菌群代謝潛能的影響

由於抗生素和益生菌會影響小鼠腸道菌群的結構和組成,因此可以預測其糞便功能宏基因組會發生變化。通過HUMAnN2分析糞便宏基因組中的功能基因,得到485條通路(表S2)。272條途徑的基因豐度在三組中顯著改變(P<0.05;表S3)。在CT組、MC和NC組之間發現了9條差異顯著的豐富通路,這可能與添加外源Probio-M9有關(CT組P<0.05,MC和NC組P>0.05;表S4)。

在植入腫瘤和抗PD-1治療階段,CT組生物素生物合成I、異乳酸發酵、甘露聚糖降解、硝酸鹽還原VI(同化)、戊糖磷酸途徑、丙酮酸發酵為丁醇II、糖酵解和Entner-Doudoroff、CDP -二酰基甘油生物合成I的基因豐度增加,而其他途徑,如8-氨基-7-氧硝酸生物合成I、己糖醇發酵為乳酸、甲酸、乙醇和乙酸、乙酰輔酶A生物合成超途徑、全反式法尼醇生物合成、硫酸軟骨素降解I、N -乙酰神經氨酸降解超途徑等途徑含量較低(圖5)。在抗PD-1免疫治療期間,益生菌干預的功能性腸道宏基因組保持不變,這可能是Probio-M9協同抑瘤的原因

42801640906334911

圖5 Probio-M9對腸道宏基因組潛能的影響。添加Probio-M9後,通路的基因豐度顯著增加(A),降低(B)。分組:藥物對照(MC);聯合治療(CT)。*代表P < 0.05;* * 代表P< 0.01(原文中圖4)。

討論

本研究使用抗生素破壞小鼠腸道菌群構建結直腸癌體內異味模型,評估益生菌L. rhamnosus Probio-M9對基於PD-1的ICB治療的影響。有趣的是,在後續ICB治療中,抗生素後使用益生菌可增強小鼠對腫瘤生長的抑製作用,其抑瘤效果明顯強于未使用益生菌的小鼠(P<0.05)。這與前期研究的觀察結果一致,説明Probio-M9對正位和異位結腸癌的治療均有促進作用

在動物實驗的不同階段採集糞便樣本進行宏基因組測序,監測抗生素、益生菌和抗PD -1處理期間/處理後腸道菌群的動態變化。抗生素的使用不僅降低了糞便微生物的多樣性,而且也改變了其組成。抗生素應用選擇了耐藥菌譜,特別是A. muciniphila,同時增加了其他潛在有害菌的比例,如Escherichia coli 和Enterococcus gallinarum。這些菌種與腫瘤有關,甚至與ICB治療中患者的無反應性有關。Probio-M9能有效恢復抗生素治療後小鼠的腸道菌群多樣性和結構。受損的腸道菌群的恢復有利於後續的抗PD -1免疫治療。

數據顯示,在小鼠腸道中最佔優勢之一的屬是Bacteroides,但受抗生素和益生菌影響顯著。Probio-M9提高了Bacteroides intestinalis 和 Bacteroides xylanisolvens的相對豐度,有利於宿主的健康。Bacteroides testinalis可以通過産生代謝産物或誘導IL-1β轉錄來增強宿主免疫,且與癌症治療結果呈正相關。另一項研究中,擬桿菌的相對豐度被Probio-M9降低,在對ICB治療無反應的患者中富集。因此,Probio-M9可能對不同的結腸擬桿菌種類有不同的調控作用。值得注意的是,添加Probio-M9後,P. disasonis和B. pseudolonggum的豐度顯著增加。P. disasonis與抗腫瘤免疫治療的有效性相關,並被認為是聯合ICB治療的預測指標,而B. pseudolonggum可以通過代謝産物的産生增強免疫治療反應。在抗PD-1治療的荷瘤小鼠中給予Probio-M9,通過增強有益菌抑制有害菌,可以促進抗腫瘤免疫應答。

由於抗生素和益生菌的作用改變了小鼠的腸道菌群,接受抗PD -1治療小鼠的功能宏基因組也被調節。CT組的功能宏基因組與兩組非益生菌治療組不同。Probio-M9富集糖降解相關途徑(如糖酵解和Entner-Doudoroff途徑、磷酸戊糖途徑、甘露聚糖降解途徑)、維生素和氨基酸合成途徑(如8-氨基-7-氧壬酸鹽生物合成I、生物素生物合成I、L-isoleucine生物合成IV)。這些功能變化通過調節能量代謝和産生維生素B7等有益代謝産物來提高和維持宿主免疫力。宏基因組功能潛力的調節,特別是上述途徑,可能是益生菌增強宿主免疫從而提高抗PD -1免疫治療效果的另一種機制(圖6)。

然而本研究也有一定的局限性。Probio-M9調節免疫系統和協同ICB治療的機制主要來自於分類學和功能宏基因組學分析;因此,這裡得出的結論在很大程度上是觀察性的,在這個階段仍然是假定的。應設計更精細的實驗來解析和闡明益生菌作用的生理和分子機制。此外,益生菌使用的安全性以及任何其他新産品/管理策略的安全性都是最重要的。雖然單靠攝入益生菌不太可能使患者腸道菌群組成劇烈變化,但改善的效果確實依賴於益生菌對患者腸道菌群及其功能的調節作用。即使本研究的結果可以作為臨床前證據支援輔助使用益生菌ICB治療,在將這種治療方法應用於常規臨床實踐之前,仍需要進行充分的隨機對照試驗和安全性評估。

2051640906335100

圖6 提出益生菌Probio-M9協同抗腫瘤作用的機制,通過改善抗生素破壞的腸道菌群抗PD-1治療。紅線和藍線分別表示抗生素或Probio-M9對之前被抗生素或Probio-M9調節的腸道微生物群的影響。綠線表示抗PD-1治療的抗腫瘤活性。箭頭和鈍端分別表示促進和抑製作用(原文中圖5)。

結論

本研究使用抗生素破壞小鼠的腸道菌群,用益生菌或天然方法修復後進行腫瘤移植,隨後以抗PD-1為基礎的抗腫瘤治療。在實驗的不同階段監測糞便宏基因組的變化及抑瘤效果,可以發現Probio-M9與ICB治療協同作用,顯著抑制了腫瘤,還能有效恢復被抗生素破壞的糞便微生物群。因此,在不可避免使用抗生素後補充益生菌可有效改善ICB治療的結果和反應性,Probio-M9可作為未來基於微生物協同腫瘤治療研究的候選菌株。

      中國網是國務院新聞辦公室領導,中國外文出版發行事業局管理的國家重點新聞網站。本網通過10個語種11個文版,24小時對外發佈資訊,是中國進行國際傳播、資訊交流的重要窗口。

      凡本網註明“來源:中國網”的所有作品,均為中國網際網路新聞中心合法擁有版權或有權使用的作品,未經本網授權不得轉載、摘編或利用其他方式使用上述作品。

電話:0086-10-88828000

傳真:0086-10-88828231

媒體合作:0086-10-88828175

品牌活動合作:0086-10-88828063

廣告合作:0086-10-88825964