初步研究揭示人類糞便微生物組的組成變化與偶氮還原活性的關係

點擊藍字↑↑↑“微生態”,輕鬆關注不迷路 生科雲網址:https://www.bioincloud.tech 編譯:微科盟大頭蝦,編輯:微科盟茗溪、江舜堯。

導讀  

背景:通過微生物酶庫,腸道菌群在很大程度上促進了人體代謝過程,影響營養物質、藥物和環境毒素。偶氮還原酶(Azoreductases)是一種主要的微生物源酶,參與外源代謝和藥物激活,但目前我們對腸道菌群組成變化與其偶氮還原活性之間的關係知之甚少。

結果:為此,我們使用高通量16S rRNA擴增子測序,結合Illumina MiSeq,確定了16個不同偶氮還原活性的成人糞便樣本的微生物群落組成。高偶氮還原活性與厚壁菌門Firmicutes (特別是鏈球菌Streptococcus 和糞球菌屬Coprococcus)的相對豐度呈正相關,而與擬桿菌門Bacteroidetes (特別是擬桿菌屬Bacteroides) 的相對豐度呈負相關。Firmicutes/Bacteroidetes之間以及Prevotella/Bacteroides之間的比率在樣品間存在典型的差異。關鍵微生物類群的相對豐度和其他多樣性參數的多變數分析證實厚壁菌門 (Firmicutes) 的比率是區分高偶氮還原菌和非偶氮還原菌的主要變數,而擬桿菌門 (Bacteroidetes) 的相對豐度與偶氮還原菌、性別和BMI相關。

結論:本初步研究顯示,Firmicutes富集于具有較高偶氮還原活性的糞便樣本中,而Bacteroidetes相對較少。但需要更多來自不同地理區域的樣本和研究來支援這一結論。對不同産生偶氮還原酶的腸道微生物進行更好的表徵,將增加我們對含偶氮還原酶藥物或口服化學品的命運和人類不同反應的知識,從而有助於在精準醫學和毒理學中實施微生物組檢測。

 

論文

名:Compositional variation of the human fecal microbiome in relation to azo-reducing activity: a pilot study

一項初步研究揭示人類糞便微生物組的組成變化與偶氮還原活性的關係

期刊Gut Pathogens 

IF:4.181

發表時間:2021.10.8

通訊作者:Ramy K. Aziz

通訊作者單位:埃及開羅大學藥學院微生物與免疫學系

DOI號:10.1186/s13099-021-00454-0

實驗設計

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實驗設計圖     表3 收集糞便樣本的志願者元數據。  

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a正常體重範圍:18.5-24.9,超重範圍:25-29.9,肥胖:30或以上。

 

結果

1 糞便樣品總脫色活性

  16個糞便標本中有6個在實驗時間內 (10 h) 亮黑水準沒有明顯下降,屬於0級脫色組。另外2個樣品具有中等偶氮還原活性 (在實驗的10 h中只導致部分脫色) ,脫色電位分為0級和1級 (圖S1)。後8個樣品具有更高的偶氮還原活性 (在實驗時間內導致完全或接近完全脫色),並被劃分為2級類別 (表1和圖S1)。

表1 新鮮糞便樣品對0.06 M亮黑的偶氮還原活性。

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實驗結束時,根據染料脫色的完整性和脫色率,將樣品分為0、1、2等3個等級。

2 微生物分析

  從16個糞便樣本中提取的DNA的高通量測序産生了2,579,071個reads (平均=161,012.5 reads /樣本)。品質評估和配對reads連接篩選出2,520,799個reads (平均每個樣本reads=157,670.50) 用於分析。稀釋曲線(Rarefaction curves)確認了合理的覆蓋度,足以分析細菌群落的優勢成員和樣品之間的比較,所有樣品的觀察到的reads數 (121,509) 稀疏度無限接近最小值。

3 微生物組剖面和腸道微生物組生物標誌物比率

  在門水準上,共鑒定出11個不同的門,其中有4個門在所有的樣品中體現出最高的豐度,包括:擬桿菌門Bacteroidetes (相對豐度範圍為40.3 ~ 66.1%,平均值為50.19%)、厚壁菌門Firmicutes (相對豐度範圍為29.2 ~ 54.7%,平均值為41.65%)、變形菌門Proteobacteria (相對豐度範圍為1.1 ~ 14.1%,均值=4.87%)和放線菌門Actinobacteria (相對豐度範圍:0 ~ 5.4%,均值=1.12%)。而其他7個門的比率較低,且未鑒定的細菌序列的相對豐度在0.005到0.053%之間 (圖1A)。

  在屬水準上,共觀察到174個屬,其中36個屬 (佔總微生物群落的88.13%) 為所有樣品共有,可視為“核心屬(core genera)”。17個屬 (代表整個群落的0.007%) 每個樣本都有一個獨特的屬 (稱為單屬) ,而其他121個屬,存在於一些但不是所有的樣本 (非核心屬) ,代表整個群落的3.95% (圖1B)。評估常用的腸道微生物組生物標誌物。Firmicutes/Bacteroidetes的比率為0.45 ~ 1.3 (平均值=0.87);Prevotella/Bacteroides的比率為0.000067 ~ 1.36 (平均值=0.15);Fusobacterium/Bifdobacterium的比率僅在6個可檢測到梭桿菌Fusobacterium序列的樣品中測量到,範圍為0.001 ~ 0.5 (表2)。

 

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圖1 在門水準(A)和屬水準(B)的糞便樣本中檢測到的微生物群落分類總結。在所有樣本中,只有40個平均相對豐度最高的屬被顯示出來。

 

表2 在分析的糞便樣本中選擇腸道微生物組生物標誌物。

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Prevotella/Bacteroides的比率>1使用粗下劃線標記出來,Fusobacterium/Bifdobacterium的比率>0使用細下劃線標記出來。

  4 與偶氮還原活性相關的關鍵類群以及腸道微生物組生物標誌物的相對豐度組成變化

  根據擬桿菌門 (Bacteroidetes) 和厚壁菌門 (Firmicutes) 的偶氮還原活性 (或缺乏偶氮還原活性) 的程度,不同樣品的擬桿菌門 (Bacteroidetes) 和厚壁菌門 (Firmicutes) 的相對豐度存在顯著差異 (Kruskal Wallis 檢驗,p值<0.05,圖2A)。由於Firmicutes和Bacteroidetes的相對豐度各自對所觀察到的偶氮還原酶活性有顯著但相互關聯的影響,因此Firmicutes/Bacteroidetes的比率在不同等級之間存在顯著差異 (Kruskal Wallis檢驗,p值=0.0161,圖2C)。此外,樣本間Prevotella/Bacteroides的比率差異較大,0級樣本的中位數最低 (比例為0.00072或1:1394),1級 (比例為0.00388或1:58) 和2級 (比例為0.00706或1:142)。

  儘管存在這些顯著差異 (圖 S2),但由於“2級”樣本的雙峰分佈 (圖2C) 結果沒有達到統計學意義:Prevotella/Bacteroides比率較高的樣本位於高降解菌中,但並不是所有高降解菌的比例都很高。在門水準上,樣本組成的層次聚類突出了上述Bacteroidetes和Firmicutes相對豐度的反比關係(圖S3)。在較低的分類水準上,追蹤到Bacteroidetes和Firmicutes在不同偶氮還原活性等級間的相對豐度差異顯著。在科水準上,擬桿菌目Bacteroidales下的8個科中,只有擬桿菌科Bacteroidaceae在3個等級間的相對豐度存在顯著差異 (Kruskal-Wallis檢驗,p值=0.0106)。

  Bacteroides作為Bacteroidaceae中唯一的代表菌株,相對豐度在3個等級中差異顯著 (Kruskal Wallis檢驗,p值=0.015) (圖3A),其中非降解樣品的相對豐度最高 (中位數為0.4409) 。在Firmicutes的不同科中,只有鏈球菌科Streptococcaceae在3組間存在顯著差異 (Kruskal Wallis檢驗,p值=0.0127)。最後,在屬水準上,隸屬於Streptococcaceae的鏈球菌屬Streptococcus和屬於毛螺菌科Lachnospiraceae的糞球菌屬Coprococcus的組間相對豐度差異顯著 (Kruskal Wallis檢驗,p值分別為0.0146和0.0089,圖3B)。雖然在門水準上,各類群的相對豐度差異不顯著 (圖2B),但放線菌門Actinobacteria和變形菌門Proteobacteria在3個等級中有一些科和屬的相對豐度差異顯著,包括:棒狀桿菌科Corynebacteriaceae (本質上是棒狀桿菌屬Corynebacerium,Kruskal Wallis檢驗,p值=0.0302),變形菌屬Lautropia (伯克氏菌科Burkholderiaceae) 和副球菌屬Paracoccus (紅桿菌科Rhodobacteraceae),(Kruskal Wallis檢驗,p值=0.0302)。在屬水準上,樣品組成的層次聚類表明,在可檢測偶氮還原活性的樣品 (1級和2級樣品) 中,Coprococcus, Ruminococcus, Blautia和Adlercreutzia相對豐度較高。而另一方面,Bacteroides在非降解樣品中更豐富 (圖4)。

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圖2 Bean/Violin圖表示不同偶氮還原活性等級糞便樣本中核心門 (A和B) 和腸道微生物組生物標誌物 (C) 的相對豐度。在門水準上,A和B因尺度不同而分開。經Kruskal Wallis檢驗的顯著差異p值 (p<0.05) 顯示在每個版塊上方,還指出了事後兩兩檢驗中顯著差異的p值。

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圖3 Bean/Violin圖表示不同偶氮還原活性等級組間擬桿菌門Bacteroidetes (A) 和厚壁菌門Firmicutes (B) 不同屬的相對豐度,經Kruskal-Wallis檢驗和事後兩兩檢驗評估的p值有顯著差異 (p<0.05)。

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圖4

  在屬水準的腸道菌群組成的層次聚類的可視化熱圖。樣品根據不同的標準進行分類,並根據其偶氮還原活性進行排列。熱圖上方的顏色代表樣本所屬的偶氮還原活性、受試者性別和受試者BMI類別。熱圖顏色 (藍色到深紅色) 顯示了所有樣本中每個分類單元的行比率相對豐度。聚類基於歐氏距離。 

5 α和β多樣性分析

  如果不能在性別和BMI組之間發現其存在差異 (圖S4和S5),則常見的α多樣性指標均不顯著,而樣品的偶氮還原活性等級顯著影響其多樣性,但對豐富度沒有影響 (圖5)。而樣本組間多樣性分析 (β多樣性) 並未顯示出明顯的聚類模式。

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圖5

  不同偶氮還原活性等級之間的α多樣性指標 (使用OTUs、Chao1、Shannon和Simpson多樣性指數進行觀察) 的箱線圖。通過Kruskal-Wallis檢驗估計顯著差異,然後進行非參數事後兩兩檢驗,p值<0.05。

  6 多變數分析

  由於樣本量小,且研究對象之間存在BMI差異,我們使用線性模型進行了多變數分析,以估計每個測量變數對物種多樣性指標和相對豐度差異的貢獻程度。具體來説,我們試圖驗證Firmicutes、Bacteroidetes和α多樣性之間的變化是否真的與樣品的偶氮還原活性有關,還是由於混雜因素,如BMI (表S1)。偶氮還原活性與Firmicutes和Bacteroidetes的相對豐度顯著相關 (p值分別為0.0081和0.0007)。而Bacteroidetes相對豐度受性別和BMI的影響顯著 (p值分別為0.0087和0.0451)。另一方面,年齡和BMI均與Actinobacteria豐度顯著相關 (p值分別為0.0148和0.0215,表S1)。同樣地,一項基於相同的4個協變數與腸道生物標誌物比值的多變數分析中,篩選出Firmicutes/Bacteroidetes的比率可作為一個具有偶氮還原活性的顯著協變數 (p值=0.0045,表S2)。偶氮還原活性、年齡、性別和BMI與多樣性指數的多變數分析表明,偶氮還原活性、性別和BMI對樣本豐富度沒有顯著貢獻,而年齡僅與Chao1豐富度指數具有顯著的協變數。同時,多變數分析也證實了Simpson多樣性指數是偶氮還原度的預測因子 (p值=0.0329,表S3)。

討論

  人類腸道含有數萬億個代謝活性微生物細胞,這些細胞用數百萬個基因及其編碼的酶豐富了人類基因庫。偶氮還原酶 (Azoreductases,由人類腸道菌群的幾個成員表達) 極大地影響偶氮的代謝,廣泛用於食品和制藥。腸道微生物群組成預計會影響許多藥物和含有偶氮染料的化合物的代謝。在不考慮腸道菌群組成的情況下,將這些含偶氮藥物/外源性藥物應用於不同人群,可能會影響這些藥物的代謝和生物利用度。在這項研究中,為了減少飲食和生活方式的差異,我們從同一個社區收集了16份糞便樣本,並使用16S rRNA擴增子測序對其核心微生物群進行了定義。該分析是公認的小樣本量,旨在以一個試點比較分析的微生物組結構,聯繫腸道微生物群落的整體偶氮還原活性。儘管在過去的幾年裏微生物組研究大量涌現,但在埃及進行的腸道微生物組研究很少,而且沒有一項研究關注于外源性化合物降解表型。

  早期的微生物組研究報告稱,厚壁菌門 (Firmicutes) 和擬桿菌門 (Bacteroidetes) 在腸道中佔主導地位 (相對豐度約為90%),但程度差異很大,同時很多學者認為Firmicutes/Bacteroidetes的比率是人類腸道菌群狀態的重要生物標誌物。因為Firmicutes和Bacteroidetes在腸道中共存意味著資源競爭最小化。腸道微生物群狀態/健康的另一個重要生物標誌物是Prevotella/Bacteroides的比率,這被認為是成功減脂的預測指標,特別是在高纖維和全穀物飲食中。在我們的研究中,糞便樣品的微生物組特徵具有典型的腸道微生物組特徵,Firmicutes和Bacteroidetes佔微生物種群的92%。該研究的一個重要發現是,高偶氮還原活性與Firmicutes正相關,而與Bacteroidetes負相關。這可能是因為Firmicutes的基因組中含有豐富的偶氮還原酶編碼基因。然而,Proteobacteria取代Firmicutes成為偶氮還原酶的産生菌;可是,在不同的糞便樣本中,它們的相對豐度並沒有顯著或一致的變化,這可能是由於它們在腸道菌群中的總體相對豐度低於Firmicutes和Bacteroidetes。因此,高偶氮還原糞便樣品比低或未降解糞便樣品具有更高的Firmicutes/Bacteroidetes的中位數比率。

  此外,Prevotella/Bacteroides的中位數比率在高偶氮還原組較高,但由於組內變異性高,未達到統計學意義。儘管一些Bacteroides菌株以其偶氮還原活性而聞名,而Prevotella菌株中由於沒有偶氮還原酶,可能在一些高偶氮還原樣品中相對富集。因為它與Bacteroides呈負相關,而實際的活性是取決於這些樣品中Frimicutes的成員。通常情況下,當Bacteroides在樣本中含量高時,Prevotella含量低,反之亦然。對於Prevotella在偶氮還原劑中相對豐度的高變異性的另一種解釋,可能是在某些Prevotella菌株中尚未發現偶氮還原酶活性,或者該活性具有特異性,因此不能通過16S rRNA分析解決。

  在屬水準上,α多樣性的Simpson多樣性指數存在顯著差異,但豐富度差異並不顯著。這一結果表明,類群的區別在於其均勻性,而不是數量。根據偶氮還原活性分類樣本 (並通過UniFrac加權方法估計) 的β多樣性表明,他們沒有特定的聚類模式。一種可能的解釋是:雖然Frimicutes似乎對最終偶氮還原酶活性有明顯的影響,但不同的Frimicutes屬在不同的樣品中佔優勢,沒有觀察到特定的分類群;然而,這些屬的存在似乎可以編碼足夠的偶氮還原酶。Fusobacterium/Bifdobacterium的比率被認為是腸道微生物群失調的一個生物標誌物。據報道,結直腸癌患者Bifdobacterium的相對豐度降低,同時伴之以柔嫩梭菌Faecalibacterium prausnitzii豐度增加。不出所料,在這項研究中,Faecalibacterium菌株在10個樣本中為0,而在其他6個樣本中可忽略不計,可能原因是我們所有的樣本都是從沒有報告疾病的受試者中收集的 (除了一個受試者肥胖以外) 。

  最後,我們對不同細菌類群和腸道微生物組生物標誌物的相對豐度與參與者的年齡、性別和BMI進行了多變數分析,以排除觀察到的相關性是由混雜因素引起的。不變的是,偶氮還原活性被發現是Firmicutes相對豐度的關鍵因素,也是與Bacteroidetes相對豐度的顯著協變數之一,從而影響Firmicutes/Bacteroidetes比率。另一方面,BMI是Bacteroidetes和Actinobacteria的關鍵協變數。這些結果和Kim等人報道的放線菌門與體重呈正相關結論保持一致。此外,一項對瘦雙胞胎和肥胖雙胞胎的腸道微生物群的調查發現,肥胖受試者中Actinobacteria的水準較高。Kim等也報道了年齡顯著增加了Actinobacteria門中的Coriobacteriia 綱和紅蝽菌科Coriobacteriaceae的比率,而La-ongkham等人觀察到,成人受試者中Actinobacteria的相對豐度明顯比老年人高約2.3倍。在此,我們證明了年齡與Chao 1豐度和Actinobacteria相對豐度具有顯著的協變數關係,但與其他3個主要門的協變數關係不顯著。

  結論

  總之,本文在一項初步研究中分析了16名埃及成年志願者的糞便微生物群落,以將微生物群落組成與其偶氮還原活性聯繫起來。我們觀察到與人類腸道環境相關的主要類群,並揭示了典型的腸道微生物群特徵。儘管本研究樣本量小,但採用多變數+單變數分析表明有統計學意義的趨勢顯著。菌群的增殖表明,不同還原級別樣品的Firmicutes/Bacteroidetes和Prevotella/Bacteroides的比率存在差異,證明Firmicutes的相對豐度可能是影響最終還原氮活性的最顯著因素。此外,不同偶氮還原等級的樣品均勻度差異較大。本研究的主要限制是小樣本量和缺乏因果關係背後觀察統計關聯的證據。

未來的研究應該通過:

1) 分析更大的隊列;

2) 通過組合和比較來自不同地理位置、代表不同飲食和生活方式的不同人群的樣本

3) 使用動物模型或腸道微生物群的離體模型來研究因果關係 (例如,通過實驗改變Firmicutes/Bacteroidetes的比率和測量偶氮還原酶活性) 等方式來解決這些局限性。

此外,鳥槍宏基因組學、宏蛋白質組學、代謝組學和功能性宏基因組學策略都可能為微生物群參與氮還原過程的機制的洞察提供證據。此外,本研究的結果突出了表徵偶氮還原酶産生的腸道細菌的重要性,尤其是擬桿菌門Bacteroides和普雷沃氏菌Prevotella,這些細菌還沒有像厚壁菌門Firmicutes和變形菌門Proteobacteria那樣被研究過,它們可能有重要的菌株水準變化。這些研究將有助於增加我們對含偶氮染料的藥物或化學品的命運,以及人類對它們的不同反應的知識。這些結果還將指導更有效的藥物和劑型的開發,並將有助於在精確醫學和毒理學中實施微生物組檢測。


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