新冠檢測不建議報告CT值,原來是這些擔憂!

今年早些時候,AACC發表了一份公開聲明,建議在管理 COVID-19 患者時不要在 PCR 檢測中使用 Ct 值。

10月11日,發表在美國臨床化學協會《臨床化學》雜誌上的一項新研究強化了AACC的建議,即不要使用週期閾值(CT值)來確定SARS-CoV-2 PCR檢測的性能。

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今年早些時候,AACC發表了一份公開聲明,建議在管理 COVID-19 患者時不要在 PCR 檢測中使用 Ct 值。它指出,定量檢測的驗證更為複雜,需要更嚴格的測試來確保性能,例如確定量化的下限,而不是檢測的下限。

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這項由LGC英國國家測量實驗室的研究人員領導的獨立研究,調查了在英國、比利時和南韓的三個實驗室用PCR對6000多名接受SARS-CoV-2檢測的患者。

研究小組利用世界衛生組織建議的Ct截止25作為測試結果,發現臨床敏感度從100%下降到16%到90%之間,這取決於患者群體。

研究人員查看了另外732個實驗室,發現根據實驗室的不同,單個Ct值可以對應不同的病毒載量。

該小組的負責人吉姆·哈格特(Jim Huggett)在一份聲明中説,雖然Ct值可能有助於流行病學評估,但"應該避免將這些值作為衡量個人患者分層或...分析性能目標。

他説:"如果要進行量化,就應該探索根據適當標準的校準品來實現。

AACC提出影響CT值的原因   在COVID-19大流行期間,許多RT-PCR檢測被FDA授權用於緊急使用,或作為實驗室開發的新冠核酸定性檢測試劑(LDT)進行驗證。然而,美國一些衛生保健提供者和公共衛生機構要求實驗室報告數字CT值以及標本檢測到新冠核酸時的定量結果。 根據臨床和實驗室標準研究所(CLSI), CT 值是 "擴增儀器在背景之上可檢測所需的週期數"。換句話説,CT 值是放大目標序列的熒光探頭信號>用戶驗證期間確定的最小檢測級別的最低 PCR 週期數。較低的 CT 值與測試樣本中目標病毒序列(複製號)的較高數量相關。 24461634628173633 

根據統一術語數據庫,CLSI 和 ISO 15189 指定了三個檢測階段:分析前、分析中和分析後。影響三個階段中每個階段 CT 值的因素如下表。

分析前

導致 CT 值變化的各種分析前環節,包括患者準備、生物差異、標本類型以及運輸和儲存(表 1)。 因素 解釋

表1.影響分析前CT值的因素



患者準備在前鼻孔、中葉或鼻咽收集之前不去除多餘的粘液,或在吃完食物之後未做漱口,都可能導致CT不準確的結果。
暴露和標本採集之間的時間如果採集標本太早(例如暴露後前 3 天內)或太晚(例如症狀發生後 >7 天),則可以得出假陰性結果。
標本收集有效率不規範的標本採集可能導致結果不準確
生物差異左右鼻孔、一天中的時間、患者年齡和生物地理祖先 (BGA) 之間的差異也會影響結果
媒介結果可能因介質而異(例如幹拭子、PBS、病毒運輸介質、通用運輸介質)
標本類型結果可能因標本來源、取樣部位而異(例如鼻拭子、咽拭子、唾液、痰等)
運輸和儲存運輸條件和溫度可能會影響結果
標本年齡應定義標本穩定性。如果收集和測試之間的時間超過穩定窗口,結果可能不準確

分析中

影響實際檢測期間 CT 值的因素包括提取效率、熒光探針選擇和試劑批次差異(表 2)。 因素 解釋

表2. 影響分析中CT值的因素



核酸回收效率 (非萃取方法)缺乏濃縮能力,潛在的抑制和基質效應會影響結果
核酸提取效率 (提取方法)不同程度的萃取效率和基質效應會影響結果
抑制檢測沒有可用的對照來檢測檢測抑制可能産生假陰性結果或假高CT值
基因目標 (多個與單個)CT值可能因基因靶點及其不同的放大動力學而不同,導致相同或不同標本的結果差異
熒光檢測設計用不同熒光團標記同一基因靶點的探針將增加結果的可變性
變異的影響引物/探針的結合可能會受到變異的影響,導致CT值的改變
定義週期閾值根據CT閾值的定義(例如,使用固定於CT值的校準器)或閾值的計算(例如,手動vs.自動化),可能會出現假陽性和陰性結果。
認證參考物質缺乏認證的參考物質,如校準器,使得確認結果的準確性和驗證作為定量LDT的分析具有挑戰性
CT值的平臺差異平臺有不同的敏感性和截止值。沒有建立國際單位。因此,結果無法跨平臺標準化
CT值範圍可靠性由於缺乏準確性,不應報告線性範圍以外的CT值
試劑批間差CT值可能因試劑批次而異。除非新試劑批次是用校準過的或先前描述過的材料來驗證的,否則變化的程度是未知的
人員和操作誤差結果可能會因操作人員和一天中的時間而不同,特別是手動方法

分析後

在分析後的過程中,除檢測靶標、可報告單位和檢測目標等因素外,CT值還會傳遞給醫療保健提供者(表3)。 因素 解釋

表3.影響 檢查後CT值的因素



檢測目的CT值的解釋和使用取決於檢測目的,如篩查、監測、診斷、監測、復工、術前、出院管理、傳染性等
檢測順序不鼓勵用不同的基於pcr的檢測方法縱向監測給定的患者,因為分析之間的可變性
傳染性與病毒檢測病毒檢測不等於傳染性。表明感染病毒的CT值範圍需要通過細胞培養研究確定。
患者具體因素免疫和/或接種疫苗情況可能會影響CT值的效用
可報告單位CT(週期數)、ng/uL、TCID50/mL、基因組拷貝數/mL、RNA NAAT檢測單位(NDU)/mL之間缺乏相關性,可能使結果解釋複雜化
手動操作手工方法更容易出現錯誤(例如,數據輸入錯誤),特別是在沒有遵循品質步驟的情況下
趨勢對於意外變化(即CT相對於其他測量值的顯著變化)缺乏LIS或品質標誌可能會影響結果
再感染/復發可能發生相同或不同變異的繼發性感染,CT值的解釋尚不清楚
檢測目標PCR-靶標丟失/靶標序列變異的初始和重復試驗可能不一致

如果實驗室必須報告CT值需注意 

AACC承認實驗室在CT值方面處於一個尷尬的位置。正如本文所總結的,報告CT值有許多局限性。雖然實驗室意識到這些局限性,但也可能有來自臨床同事的壓力,要求報告或至少獲得CT值。 對於決定報告CT值的實驗室,AACC建議包括下面的解釋性內容,以減少與報告CT值相關的潛在風險。AACC建議將這一意見附加到結果中,並在實驗室報告中突出顯示。實驗室可能還需要考慮分析的特定CT範圍,假設精度可接受,提供半定量結果(例如,低、中、高病毒RNA)和/或基於校準儀的delta計算CT值。 不鼓勵使用CT值來指導患者管理,對於新冠病毒定性檢測,尚未確定病毒載量與傳染性的相關性。生物差異、樣品充足性、接觸時間、儀器、方法學、認證參考物質的缺乏以及監管因素等諸多因素都會影響新冠病毒定性檢測中檢測到的CT值。因此,AACC不鼓勵報告或披露CT值以指導患者管理。 

相關點評: 

1.實時熒光PCR是定性方法 

CT值因為有數值把原本半定量(就是定性)的實時熒光PCR方法包裝成了定量的方法,但是定量方法的建立與驗證比定性方法的建立與驗證更加嚴格和複雜,參見GB/T27417-2017 合格評定 化學分析方法確認及驗證指南。目前實時熒光PCR方法的建立和驗證都是參照定性方法的參數。 93191634628173801 

2.CT值不具有可比性 相同條件下同一次實驗的2個樣本的CT值具有比較的意義。但是,CT值可以受到引物探針設計、熒光基團、擴增效率、反應體系、儀器平臺、軟體優化等一系列因素影響,導致CT值無法作為一個恒定的量值進行相互比較。另外,只有在實時熒光PCR方法的有效線性範圍內CT15-35,CT值才比較穩定,CT值大於35受到泊松分佈概率的影響,CT值呈現一定的隨機性。

  參考資料:

  1. CLSI: Harmonized Terminology Database. Accessed March 30, 2021. https://htd.clsi.org/listterms.asp?searchdterm=reproducibility&button=Submit

  2. Ginzinger DG. Gene quantification using real-time quantitative PCR: An emerging technology hits the mainstream. Exp Hematol. 2002;30(6):503-512. doi:10.1016/S0301-472X(02)00806-8

  3. Is there variability in Ct values? doi:10.1093/cid/ciaa1199

  4. IDSA and AMP Joint Statement on the Use of SARS-CoV-2 PCR Cycle Threshold (Ct) Values for Clinical Decision-Making.

  5. First WHO International Standard for SARS-CoV-2 RNA. Accessed April 22, 2021. https://www.nibsc.org/products/brm_product_catalogue/detail_page.aspx?catid=20/146

  6. Binnicker MJ. Challenges and controversies to testing for COVID-19. J Clin Microbiol. 2020;58(11). doi:10.1128/JCM.01695-20

本文來源:IVD從業者網

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