CAR不止于腫瘤治療,CAR在感染性疾病和自身免疫疾病的新發展

CAR技術遠不止于腫瘤治療,在感染性疾病治療及自身免疫疾病中也有著新的發展。



 
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導讀

近年來,CAR技術高速發展,在血液腫瘤治療方面取得了突破性成功,多款CAR-T藥物獲批上市。CAR技術遠不止于腫瘤治療,在感染性疾病治療及自身免疫疾病中也有著新的發展。


圖源:《
regulatory 
T cells 
(Treg
) and their 
roles in immu
ne 
system
 with respect to 
imm
unopath
olo
gical 
dis
o
rders》

T細胞在控制癌症、傳染病和自身免疫疾病發揮著關鍵作用,其中主要兩大類T細胞協同工作,維持免疫穩態。第一個亞群是效應T細胞,能夠消除病原體和腫瘤,雖然效應T細胞反應通常是有效的,但一部分傳染病和腫瘤已經進化出各種各樣的逃逸機制來繞過T細胞控制;第二個亞群是調節性T細胞(Treg),調節自身免疫反應,在自身免疫疾病中也存在一定局限。

圖源:https://www.creative-biolabs.com/blog/index.php/is-bio-distribution-study-necessary-for-car-t-therapy/

嵌合抗原受體 (CAR) 技術已成為重編程T細胞一種有前途的技術,以克服天然T 細胞的不足。CAR這一概念最早出現于1990年代,科學家發現T細胞經嵌合抗原受體及CD3胞內激活信號域修飾後,可使T細胞可直接特異性識別細胞表面抗原發揮作用。CAR技術直接改變了T細胞識別抗原的方式,繞過了MHC限制性,具有高特異性,避免了T細胞免疫逃逸。

此文獻探討利用CAR技術治療HIV以及自身免疫和移植排斥疾病機遇與挑戰。

▉CAR-T細胞清除HIV

HIV感染人體後引發抗病毒免疫,但免疫系統無法完全清除被感染的細胞,且被感染細胞會下調抗原表達來逃避免疫監視,一部分潛伏細胞休眠數年,機會性産生病毒,需終生進行抗病毒治療。早期抗病毒治療雖能減少病毒載量但不能完全清除HIV病毒。一些因素如病毒逃逸、T細胞功能紊亂、免疫細胞耗竭影響HIV病毒的清除。

CAR-T治療HIV(圖源:https://doi.org/10.3389/fimmu.2020.00361)

目前抗逆轉錄病毒治療(anti-retroviral therapy, ART)可有效控制HIV感染,但無法完全清除體內HIV病毒。


CTL細胞 (細胞毒性T細胞)是機體應對病毒感染的主力軍,但CTL細胞抗原識別具MHC限制性,CAR修飾CTL細胞能夠避免CTL細胞局限性(詳見下表),可有效控制感染,並防止潛伏病毒再激活。

靶向HIV的CART細胞歷經幾代發展逐步成形

1995-2005年一代CAR結構的靶向CD4-CART細胞證明了細胞治療HIV的安全性和可行性,但一代CAR結構中僅包含一個共刺激因子結構域,作用有限,未能持久地減少血液和組織內的病毒負荷。


隨著二代CAR結構的更新,胞內信號域含2個共刺激因子結構域4-1BB+CD3或CD28+CD3,提升T細胞的功能。較一代,基於4-1BB+CD3二代 CD4-CAR-T細胞(下圖 a)體外抗病毒效果提升了50倍,小鼠感染模型中能夠顯著降低病毒負荷。靶向HIV的二代CAR結構的CAR-T細胞,其抗原識別區域為靶向Env蛋白保守位點的scFv,包括CD4結合位點、gp41、多聚糖,為廣譜中和抗體(下圖 b)。儘管scFv-CART在體外可發揮較強的抗病毒作用應用於臨床也存在一些挑戰,需克服HIV逃逸及持久性差的困難。

CD4-CART細胞治療HIV示意圖

此外,Bi-CAR雙特異性CAR設計是將CD4與bNab中的scFv或人C型凝集素識別域(CRD)融合,CD4片段與Env蛋白的gp120亞基結合,CRD結合Env蛋白中的糖基部分,但CRD與可正常細胞結合引起副作用。(上圖 c和 上圖 d)

圖源:《Application of CAR-T Cell Therapy beyond Oncology:Autoimmune Diseases and Viral Infections》

維持CAR-T細胞體內持久性的策略

1. 多次輸注
 
持久性與CAR-T功能的發揮有著重要的關聯,CD19-CAR-T抗腫瘤的研究中,B細胞腫瘤抗原負荷能夠影響CAR T細胞的增殖和持久性,而在HIV感染中,接受cART抗逆轉錄病毒治療的個體抗原負荷影響有限。維持CAR-T細胞的持久性需多次輸注 HIV 特異性 CAR T 細胞,維持足夠數量以應對反彈。
 
 
 
2. 加強免疫治療
 
抗病毒疫苗加強免疫以維持足夠多的抗原特異性的記憶細胞。此策略也可應用於CAR-T抗病毒研究中,表達病毒抗原的CART細胞通過TCR信號途徑刺激HIV特異性CAR-T細胞,治愈HIV還需要CART細胞能夠在低抗原負荷中持久生存。
 
 
 
3. HSPC來源CART細胞
 
造血幹細胞(hematopoietic stem and progenitor cells, HSPC)具有自我更新能力,可實現持久性。造血幹細胞來源的T細胞可能會克服外周血來源的細胞在較低抗原負荷環境中的持續性差的問題。HPSC來源的一代CART細胞可以穩定生存近2年,且能避免産生CAR與TCR交叉反應的問題。
 

圖源:《Gene therapy targeting haematopoietic stem cells for inherited diseases: progress and challenges》

CAR-T治療HIV也存在諸多挑戰:

1.抗性

CAR-T細胞也會受到HIV病毒感染,保護CAR-T細胞免受HIV感染是至關重要的。CCR5是病毒進入機體的重要分子,科學家將靶向CCR5的shRNA基因整合到CAR-T 細胞中,shRNA下調CCR5表達防止病毒感染CART細胞。此外,研究者採用鋅指核酸酶編輯、定點 megaTAL 核酸酶等基因編輯技術修飾CCR5阻止HIV病毒進入機體。


研究者認為攜帶完整HIV病毒的CD4+T細胞是CART治療後復發的原因,此細胞下調Nef表達逃避CTL殺傷。CTL細胞識別病毒需要MHC分子,而CAR-T細胞非MHC限制性,可識別完整的HIV病毒,裂解含HIV前病毒的CD4+T細胞。採用延遲逆轉劑LRA破壞病毒潛伏狀態,潛伏病毒可以被激活並被免疫細胞殺死,但逆轉劑並不能減小潛伏病毒數量。

 

HIV在B淋巴濾泡中發生免疫逃逸,表現為HIV特異性CTL細胞在淋巴組織中毒性降低,低表達穿孔素和顆粒酶,不能清除被感染的CD4+Tfh細胞。CART通過表達CCR5進入B淋巴濾泡中,清除病毒感染細胞,採用基因編輯修飾CART細胞可將CART細胞帶入被感染組織位點。

CART在B淋巴濾泡中的作用

2. 毒性

由於HIV的Env蛋白非自身抗原,可實現HIV特異性靶向,毒性較小但臨床上的毒性未見有報道。

3. 細胞因子風暴 

腫瘤研究中,高抗原負荷産生的細胞因子風暴比較嚴重。而對於HIV治療中,初期抗原負荷低,出現細胞因子風暴可能性小;但當CART細胞不能控制HIV時,可能會出現細胞因子風暴,通常採用IL-6或者cART終止不良反應。

4. 高成本是腫瘤和HIV治療中的共同重要問題。

總結

二代CAR-T細胞在應用於小鼠和非靈長類HIV感染模型中是安全有效的。但是,成功的CAR-T細胞治療需長期持久並能夠清除潛在的HIV病毒。目前來看增強CAR-T在較低抗原負荷中持久性及增強CAR-T耐受HIV感染還任重而道遠。
 
▉ CAR-T用於自身免疫疾病

T細胞維持機體穩態(圖源:https://doi.org/ 10.1016/j.molmet.2013.12.005)

自身免疫疾病治療常會産生副作用。CAR-T作為一種突破性療法,可直接殺死自身病理性的免疫細胞。Treg細胞在調節自身免疫性疾病起著重要作用CAR分子可以引導Treg細胞到達免疫環境中,發揮特異性的免疫抑制功能

圖源: 《Prospects of the Use of Cell Therapy to Induce Immune Tolerance

CAR Treg 細胞自身免疫疾病中的試驗

CAARS(Chimeric autoantibody receptors)嵌合自身抗體可使CAART細胞靶向破壞自身免疫B細胞,當自身免疫B細胞上的BCR受體遇到CAART細胞時,可被破壞無法産生抗體


在尋常皰疹小鼠模型中,由於自身免疫B細胞靶向自身的desmogleins蛋白,導致皮膚粘膜發生皰疹,傳統上用皮質類固醇和其他免疫抑製劑進行治療減少全身性免疫反應。CART突破性療法通過表達desmoglein3二代CAAR(4–1BB–CD3ζ胞內信號域)T細胞,與BCR相互作用,誘導自身免疫的B細胞裂解發揮作用,以此思路類推,CAART細胞可應用於其他B細胞相關的自身免疫疾病中,如系統性紅斑狼瘡、類風濕關節炎。


另一項標誌性研究,在小鼠模型中靶向TNBS的CAR Treg細胞可用於治療TNBS引起的結腸炎,體內可檢測到CAR T reg細胞,能夠以抗原特異性增殖,可運輸到靶器官並在靶器官中增殖,結果顯示CAR T reg細胞可預防或改善小鼠結腸炎。
 


圖源:《Application of CAR-T Cell Therapy beyond Oncology:Autoimmune Diseases and Viral Infections》

CAR Treg 細胞在器官移植中應用

識別 HLA 分子(human leukocyte antigen, 人類白細胞抗原)的嵌合抗原受體 (CAR) 的調節性 T (Treg) 細胞為自身免疫提供了理想的方案(見下圖)HLA因其表達量高且僅在移植器官上表達,是理想治療靶點。此外,靶向HLA的CAR Treg 細胞不會對移植細胞的功能産生影響。

HLA-A2 特異性 CAR Treg 細胞已被用於預防免疫缺陷小鼠的移植物抗宿主病 (GVHD)和皮膚移植排斥反應,體外FOXP3表達水準正常,具有良好擴增能力,細胞毒性小。重要的是,猿猴和人類 MHC 分子高度保守,可在靈長類動物上直接HLA特異性CAR評估器官移植可能性,易於動物模型的評價

CAR-Treg治療GVHD

CAR-T治療自身免疫疾病中也存在諸多挑戰:

1. 靶標選擇

與腫瘤靶標選擇類似,自身免疫靶標也需要在細胞表面高表達且具有組織特異性。腫瘤治療中靶外毒性的副作用是非常嚴重的,而自身免疫疾病治療中,CAR Treg 細胞組織外産生副作用小。然而,在某些CAR可觀察到較強的信號會使CAR Treg 細胞産生組成型抑制活性;

另一問題,CAR Treg細胞可能會優先歸巢到組織外,可能會限制特異性CAR Treg細胞療法。此外,Treg 細胞在其他健康組織中的積累可能會有利於腫瘤形成或病原體存活,這一問題目前尚未得到解決。

2.  細胞穩定性

理論上,若效應CAR-T細胞轉化為 Treg 細胞可能會加速疾病進展,但目前在癌症試驗中尚未觀察到。相比之下,若CAR Treg細胞轉化為效應T 細胞有可能加劇疾病進展,可能會引起重大的安全問題。小鼠模型研究表明,當Treg 細胞暴露于炎症環境,細胞會下調FOXP3 的表達並産生促炎作用。因此,β細胞特異性CAR Treg 細胞轉化為效應T細胞可能會造成對β細胞的殺傷,並加速I型糖尿病進展


另在Treg 細胞分離時會出現效應CAR T 細胞的污染。Treg細胞是一種罕見的細胞群,幾乎不可能達到100%的純度,分離時會帶來細胞穩定性問題。為提高CAR Treg細胞穩定性,選擇適宜共刺激因子結構域是十分重要的,研究表明CD28信號對於Treg細胞維持、增殖和功能至關重要。

圖源:《Chimeric Antigen Receptor (CAR)Treg: A Promising Approach toInducing Immunological Tolerance》

3.  安全性

起始材料影響Treg細胞的純度,存在效應T細胞污染可能會引起安全性問題。起始材料的應選擇臍帶血而非成人外周血,因為臍帶血更容易分離Treg細胞,並維持Treg 細胞早期表型

在患者無自體臍帶血時,第三方臍帶血一種可行的、安全的替代方案,已在臨床試驗中使用。在沒有合適的臍帶血細胞來源的情況下,成人PBMC也可分離幼稚的Treg 細胞。另外,自殺開關的設計能夠使CAR T 細胞發生可控的凋亡,如當 FOXP3 表達丟失或當 IL-17促炎細胞因子錶達時,誘導細胞死亡,可以減輕副作用。

4.  劑量和持久性

劑量關係到細胞藥物的安全性和有效性。CAR T細胞是一種“活的”藥物,半衰期難以確定。對最佳劑量的確定十分複雜且依賴於疾病,如用於GVHD治療中,若患者體記憶體在大量抗原可需要相對較小劑量的 CAR Treg 細胞。Treg 細胞本身是一種佔比較小的細胞群,可能需要高效的培養系統才能達到 CAR Treg 細胞的目標劑量目前CAR-T 細胞持久性的研究大部分來自外周血而非組織。原有限時,效應CAR-T 細胞可能無法做出反應。相比之下,CAR Treg 細胞能夠産響應,保護正常細胞不被清除,持久性可能優於效應CAR-T 細胞。

圖源:《Human Tregs Made Antigen Specific by Gene Modification: The Power to Treat Autoimmunity and Antidrug Antibodies with Precision》

總結

在動物模型中,CAR 技術用於治療自身免疫性疾病和器官移植免疫排斥反應顯示出前景。然而,在研究劑量之前需確定CAR的最佳胞外結合域和胞內信號域,以提高安全性、有效性和持久性。由於Treg細胞和效應T細胞之間差異以及疾病特異性要求,在開發 CAR Treg 細胞的主要治療産品方面仍有許多工作要做。

圖源 : 《Human Tregs Made Antigen Specific by Gene Modification: The Power to Treat Autoimmunity and Antidrug Antibodies with Precision》


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